中國青鳳蝶3個亞種的遺傳變異分析

楊斯琦　王亞楠　王方方　何婭　靳亞麗

摘要[目的]探討中國青鳳蝶（Graphium sarpedon Linnaeus）3個亞種的遺傳變異。[方法]對青鳳蝶3個亞種的COⅠ基因和EF-1α基因部分序列進(jìn)行測定，并對序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換顛換數(shù)和遺傳距離等進(jìn)行分析。[結(jié)果]在測得的COⅠ基因（709 bp）和EF-1α（1 064 bp）基因中，有44個變異位點，6個簡約信息位點，COⅠ基因A+T平均含量為69.3%，存在較強(qiáng)的含量偏向性，亞種間的遺傳距離相差甚小。[結(jié)論]青鳳蝶3個亞種之間沒有明顯序列差異，仍然適宜采用傳統(tǒng)的基于形態(tài)學(xué)的青鳳蝶亞種分類體系。

關(guān)鍵詞青鳳蝶；COⅠ基因；EF-1α基因；遺傳變異

中圖分類號Q969.42文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）31-0156-04

Abstract [Objective]To investigate the genetic variation in three subspecies of Graphium sarpedon Linnaeus in China.[Method] The COⅠ gene and the EF1α gene were partially sequenced.The nucleotide composition， the number of transition and transversion， genetic distance of the segment had been analyzed.[Result]There were 44 variation sites and 6 parsimonyinformative sites in combined sequence of the COⅠ gene（709 bp）and EF1α（1 064 bp） gene in the examined species. The average A+T content of COⅠ gene was 69.3%，which showed strong A+T bias. But genetic distance among subspecies were very small.[Conclusion]It has no significant sequence differences between the three subspecies， which is still suitable to use the traditional morphological classification system for Graphium sarpedon subspecies.

Key wordsGraphium sarpedon；COⅠ gene； EF1α gene；Genetic variation

青鳳蝶（Graphium sarpedon Linnaeus），又名樟青鳳蝶或青帶鳳蝶，屬于鱗翅目（Lepidoptera），鳳蝶科（Papilionidae），青鳳蝶屬（Graphium），分布于我國陜西、湖北、湖南、四川、云南、貴州、西藏、江西、浙江、福建、廣西、廣東、海南、臺灣、香港等地區(qū)[1]。青鳳蝶在我國有3個亞種，即指名亞種[G.sarpedon sarpedon（Linnaeus）]、藍(lán)斑亞種[G. sarpedon connectens（Fruhstorfer）]、斑帶亞種[Graphium sarpedon semifasciatum（Honrath）]。目前對青鳳蝶斑帶亞種的分類尚存有爭議，魏忠民等[2]通過對中國青鳳蝶標(biāo)本的觀察，歸納出6種中國青鳳蝶的變異型，描述其主要形態(tài)特征，認(rèn)為青鳳蝶的斑帶亞種是一種變型，而不是亞種。對于青鳳蝶亞種的爭議問題，以DNA序列為基礎(chǔ)的分辨依據(jù)研究較少。

目前國內(nèi)外學(xué)者結(jié)合線粒體基因和核基因等分子標(biāo)記

對昆蟲類群的系統(tǒng)學(xué)研究已有大量的文獻(xiàn)報道。線粒體DNA具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、高拷貝數(shù)、易于分離純化等特點，是研究系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳變異和分化、區(qū)分近緣種的重要工具[3]。由于線粒體基因是母系遺傳，其中所含的進(jìn)化信息并不能完全反映雙親進(jìn)化的歷史，核基因也含有豐富的生物學(xué)信息，結(jié)合適當(dāng)?shù)暮嘶驅(qū)⒏玫胤治龅惖南到y(tǒng)發(fā)育[4]。

筆者對我國分布的青鳳蝶3個亞種的COⅠ基因和EF-1α基因部分序列進(jìn)行測定，研究它們在DNA序列上的差異，以期為我國青鳳蝶3個亞種分類地位提供分子證據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

青鳳蝶3個亞種的標(biāo)本來自我國廣西、上海，包括作為外群的木蘭青鳳蝶，共 15只成蟲標(biāo)本（表1）。

1.2方法

1.2.1提取基因組DNA及PCR擴(kuò)增。

選取部分腹部或足部組織作為試驗材料，采用試劑盒insect kit（Omega）提取基因組DNA，樣品保存在-20 ℃?zhèn)溆?。試驗采用的引物序列如下?/p>

COⅠ上游引物：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′；

下游引物：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3′。

EF-1α上游引物：5′-TCGATATCGCTTTGTGGAAGTT-3′；

下游引物：5′-ACGCACGGCAAAACGACCGAGAG-3′。

PCR 反應(yīng)體積為50 μL，反應(yīng)體系包括1.25 U的 Taq DNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物分別為0.4 μmol/L，10×PCR Buffer 為5 μL，模板 DNA 溶液 2 μL（50～100 ng DNA）。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后在72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。用 Eppendorf 梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.2PCR產(chǎn)物純化、測序。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物，用DNA 凝膠回收試劑盒，對目的條帶進(jìn)行回收和純化后，連接到T載體，經(jīng)過轉(zhuǎn)化挑克隆，提取質(zhì)粒再委托上海賽默飛（Thermo Fisher）公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3序列分析及差異比較。

測定15只成蟲標(biāo)本的COⅠ和EF-1α基因部分序列，正反鏈序列拼接后，再Blast進(jìn)行序列同源性比較，基于Kimura-2參數(shù)，采用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列組成分析，如序列堿基組成（nucleotide composition）、保守位點（conservedsjtes）、變異位點（variable sjtes）、簡約信息位點（parsimony information sites）、自裔位點（singletonsites）等。選擇Tamurar Nei模型，計算各分類單元之間的遺傳距離、轉(zhuǎn)換數(shù)與顛換數(shù)比值（Ts/Tv）。

2結(jié)果與分析

2.1基因序列的確定

根據(jù)所選引物的位置，COⅠ基因和EF-1α基因預(yù)測擴(kuò)增的片段分別是709 bp和1 064 bp，電泳檢測的結(jié)果與預(yù)期相符（圖1）。運用Blast對序列進(jìn)行分

析，顯示其與青鳳蝶的COⅠ基因和EF-1α基因具有很高

的同源性。

2.2序列組成分析

除外群外，COⅠ基因部分序列共709 bp，變異位點6 bp，無簡約信息位點，自裔位點6 bp，堿基組成上 T、C、A、G的含量分別是39.1%、16.5%、30.2%、144%，A+T平均含量為69.3%，其中密碼子第2位點A+T含量最高，達(dá)90.5%，第2位點G含量最低，平均為0.4%，T含量最高，達(dá)49.0%，這表明密碼子的堿基使用頻率存在明顯的偏向性（表2）。

核EF-1α基因部分序列共1 064 bp，變異位點38 bp，簡約信息位點6 bp，自裔位點32 bp，T、C、A、G的含量分別是22.1%、28.6%、24.5%、24.8%，A+T平均含量為46.6%，其中第1位點含量最高，達(dá)到59.2%，第1位點G的含量最低，平均為15.2%，T的含量最高，達(dá)到28%，表明密碼子的堿基使用頻率也存在一定的偏向性（表3）。

通過Paup4.0b10軟件對COⅠ基因和EF-1α基因進(jìn)行PHT檢驗（同質(zhì)性檢驗partition homogeneity test），結(jié)果顯示基因進(jìn)化水平不具有顯著差異（P=1.0>0.01），因而可以將2組數(shù)據(jù)整合在一起進(jìn)行分析。利用MEGA6.0軟件，基于Kimura-2參數(shù)對COⅠ和 EF-1α基因部分序列的整合數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計堿基轉(zhuǎn)換數(shù)與顛換數(shù)比值（R）。

由表4可知，核苷酸替換發(fā)生率比較低，第3位點略高，轉(zhuǎn)換多于顛換，第1位點最保守。轉(zhuǎn)換數(shù)與顛換數(shù)比值（R）平均為1.5<2，表現(xiàn)出較為明顯的替換飽和。

2.3遺傳距離分析

基于Kimura-2參數(shù)，采用MEGA 6.0計算個體間及亞種間的遺傳距離（表5）。不含外群的個體兩兩之間的遺傳距離在0.1%～0.5%，平均遺傳距離是03%，將3個亞種進(jìn)行分組后計算遺傳距離，并與外群對照（表6），我國青鳳蝶3個亞種間遺傳距離是0.30%～034%，兩兩之間的遺傳距離相差很小，其中指名亞種[G.sarpedon sarpedon（Linnaeus）]與斑帶亞種[G.sarpedon semifasciatum（Honrath）]差異相對更小，與藍(lán)斑亞種[G.sarpedon connectens（Fruhstorfer）]的差異相對更大。

2.4系統(tǒng)發(fā)育信號檢測

采用堿基替換飽和性分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育信號強(qiáng)弱的檢測，以遺傳距離為橫坐標(biāo)，以堿基轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)為縱坐標(biāo)作散點圖（圖2）。

從圖2可以看出，隨著遺傳距離的增大，Ts增加的速度大于Tv增加的速度，且與遺傳距離之間有良好的線性關(guān)系，Tv則逐漸趨于穩(wěn)定，達(dá)到飽和。

通過Paup4.0b10軟件對數(shù)據(jù)做PTPtest序列信息檢驗，結(jié)果顯示P為0.002，表明該數(shù)據(jù)具有較顯著的系統(tǒng)發(fā)育信息，而非隨機(jī)數(shù)據(jù)，可用來進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的推斷[5-6]。

3討論

我國青鳳蝶分布有3個亞種，據(jù)《中國蝶類志》中描述，青鳳蝶的形態(tài)特征為翅窄長，底色黑，無尾狀突起，前后翅中央貫穿1列略呈方形的藍(lán)綠色斑（后翅前面的1個為白色），后翅外緣有1列綠藍(lán)色的新月斑。后翅反面近翅基有1條紅色短線，翅中部至后緣處有數(shù)條紅色斑紋。

3個亞種之間形態(tài)特征存在一些差異，青鳳蝶藍(lán)斑亞種的綠色斑偏藍(lán)，前翅頂角有1個綠斑特別?。话邘喎N的后翅色帶不全。有學(xué)者提出青鳳蝶的斑帶亞種是一種變型，而不是亞種。為此，該研究聯(lián)合2個基因序列的整合數(shù)據(jù)對青鳳蝶3亞種間遺傳變異進(jìn)行了分析。之所以選擇COⅠ和EF-1α基因聯(lián)合分析，一方面是增加系統(tǒng)發(fā)生分析的置信度[7-8]，另一方面也與2個基因各自的特點有關(guān)。線粒體COⅠ是編碼線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ的基因，是常用的分子標(biāo)記之一，它既相對保守又存在高變區(qū)，高變區(qū)內(nèi)遺傳進(jìn)化速率更快，種間的遺傳差異也更明顯，適合于種間和種內(nèi)分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)生研究[9]。EF-1α基因進(jìn)化速度比較快，它也用于分析低階元的系統(tǒng)發(fā)育，已有學(xué)者做了相關(guān)的研究，如Reed等[10]用線粒體COⅠ、COⅡ基因的全長和核基因的EF-1α基因聯(lián)合分析了鳳蝶科鳳蝶屬23個種和亞種的個體。

在鱗翅目同種個體之間，COⅠ基因的差異為025%[11]，從試驗結(jié)果來看，我國青鳳蝶3個亞種間COⅠ基因相似

度為 99.15%，核苷酸差異很小，表明COⅠ基因在個體間變異率較低。3個亞種間EF-1α基因相似度96.43%，表明存在一定的變異率。3亞種青鳳蝶在形態(tài)上的差異可能

是由于地理隔離形成，其自身的遺傳變異性非常低[12]。

從系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)看，其未顯示3個亞種間有很好的單系性，而出現(xiàn)了并系性，且各支自舉檢驗值較低（<50%），因而沒有列出發(fā)育樹，置信度低下可能是因為分子數(shù)據(jù)所提供的信息位點較少[13]，或者是COⅠ基因和EF-1α基因序列突變達(dá)到飽和。結(jié)合對3個亞種基因序列兩兩距離進(jìn)行P-distance計算，并按照亞種分組后計算遺傳距離，可以看出指名亞種和斑帶亞種的親緣關(guān)系較近，但不足以認(rèn)定斑帶亞種是屬于指名亞種的一種變型。

綜上所述，結(jié)合目前已有的2個基因部分序列和各亞種之間形態(tài)特征的差異，仍然適宜采用傳統(tǒng)的基于形態(tài)學(xué)的青鳳蝶亞種分類體系。

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