疊氮化鈉（NaN3）誘變?cè)谧魑镄誀罡牧贾械膽?yīng)用

錢(qián)玉源 韓軒 劉祎 崔淑芳 張海娜 王廣恩 金衛(wèi)平 李俊蘭

摘要化學(xué)誘變是作物改良中變異性狀的重要來(lái)源之一，是目前應(yīng)用較為廣泛的誘變育種技術(shù)。綜述了以疊氮化鈉（NaN3）為誘變劑的化學(xué)誘變技術(shù)在作物性狀改良方面的研究進(jìn)展，并展望了NaN3誘變的應(yīng)用前景，以期為相關(guān)研究者提供參考。

關(guān)鍵詞疊氮化鈉（NaN3）；化學(xué)誘變；性狀改良

中圖分類(lèi)號(hào)S503.52文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）35-0136-03

AbstractChemical mutagenesis is one of the most important sources of variation traits in crop improvement. It is the most widely used mutagenic breeding technology. In this paper， the chemical mutagenesis technology with sodium azide （NaN3） as a mutagen was reviewed， and the research progress on the improvement of crop characters was reviewed， the application of sodium azide was prospected，in order to provide reference for the relevant researchers.

Key wordsSodium azide（NaN3）；Chemical mutagenesis；Character improvement

變異是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)動(dòng)力，也是保證物種多樣性的前提[1]。然而自然變異的頻率極低，很難滿足作物改良對(duì)變異的需求。自20世紀(jì)初開(kāi)始，科學(xué)家們嘗試?yán)没瘜W(xué)藥劑誘發(fā)基因突變，結(jié)果證明化學(xué)試劑可以顯著提高生物突變率。1941年，Auerbach和Robson第一次發(fā)現(xiàn)芥子氣可以誘發(fā)基因突變從而揭開(kāi)了化學(xué)誘變育種的序幕[2]。

化學(xué)誘變技術(shù)具有使用方便，特異性較強(qiáng)和誘變后代較易穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，已成為利用較為廣泛的誘變育種技術(shù)[3]。

疊氮化鈉（NaN3）是作物育種中最常用的化學(xué)誘變劑之一，其以堿基替換的方式，影響DNA的正常合成，使DNA單鏈斷裂，是一種有效點(diǎn)突變劑。NaN3對(duì)農(nóng)作物誘變效率高，M1代生理?yè)p傷小，使用方便和費(fèi)用低廉，是一種安全、高效的化學(xué)誘變劑[3]。

1NaN3誘變的機(jī)理

NaN3為前誘變劑，本身不具有誘變效應(yīng)，需要通過(guò)植物代謝活動(dòng)轉(zhuǎn)變成誘變劑。NaN3被植物吸收后，經(jīng)植物代謝，轉(zhuǎn)化成L-疊氮丙氨酸（一種氨基酸類(lèi)似物）。疊氮丙氨酸進(jìn)入細(xì)胞核后，在DNA復(fù)制時(shí)與DNA發(fā)生作用，誘導(dǎo)基因組產(chǎn)生點(diǎn)突變[4]。

NaN3在pH=3的酸性介質(zhì)中誘變效果更好。在pH=3的酸性介質(zhì)中，N3-結(jié)合H+生成HN3，不帶電荷的HN3更容易穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞中，經(jīng)L-疊氮丙氨酸酶催化產(chǎn)生具有誘變活性的L-疊氮丙氨酸[5]。

NaN3處理的材料需處在DNA復(fù)制活躍狀態(tài)，以種子為處理材料時(shí)需要提前浸種處理，使種子處于萌動(dòng)狀態(tài)[6]。

2 NaN3在作物改良中的應(yīng)用

種質(zhì)資源是作物改良的遺傳基礎(chǔ)，然而目前親本材料遺傳多樣性的狹窄限制了作物改良的進(jìn)程?；瘜W(xué)誘變方法是應(yīng)用比較成熟的創(chuàng)制種質(zhì)材料的方法之一，加之其操作簡(jiǎn)單和費(fèi)用低廉深受育種者的青睞。NaN3作為最常用的化學(xué)誘變劑之一，已成功應(yīng)用于多種作物農(nóng)藝性狀改良和基因功能驗(yàn)證。

2.1處理方式

NaN3誘變處理方式可以分成兩大類(lèi)：NaN3單一處理和NaN3與其他誘變劑（方法）復(fù)合處理。復(fù)合處理與單一處理相比，對(duì)于不同的作物或不同的性狀有著不同的誘變效率。所以在選擇處理方式時(shí)，需要根據(jù)作物自身和待改良的性狀，參考已有的研究結(jié)果，選擇適合的處理方式。

2.1.1單一處理誘變效率高于復(fù)合處理。

在CO2激光與NaN3、γ射線復(fù)合處理水稻的誘變效應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，NaN3和γ射線單一處理較激光與NaN3或γ射線復(fù)合處理，葉綠素和高稈突變頻率有所提高。而早熟突變和矮稈突變頻率顯著提高，表現(xiàn)出明顯的累加效應(yīng)。尤其是γ射線加激光處理的早熟突變頻率達(dá)1.35%，NaN3加激光處理的矮稈突變頻率達(dá)3.11%，是較為理想的誘變方法[7]。

2.1.2復(fù)合處理誘變效率高于單一處理。

利用γ射線與NaN3復(fù)合處理煙草，研究其對(duì)于煙草農(nóng)藝性狀的誘變效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合處理較單一處理可以提高M(jìn)2代的突變頻率[8]。

復(fù)合處理在苗高、根長(zhǎng)、苗高活力指數(shù)和根長(zhǎng)活力指數(shù)方面表現(xiàn)累加效應(yīng)，在染色體畸變方面存在協(xié)同作用[9]。用4個(gè)粳型水稻品種為材料，研究了30 keV下4種劑量N+離子注入和2種濃度NaN3單獨(dú)和復(fù)合處理的生理效應(yīng)和誘變效應(yīng)。結(jié)果表明，與單獨(dú)處理相比，復(fù)合處理的生理?yè)p傷加劇，M2代葉綠素突變頻率增高，提高了誘變效率。4.0×1016 N+/cm2和6.0×1016 N+/cm2離子注入復(fù)以2.0 mmol/L NaN3處理，以及4.0×1016 N+/cm2和8.0×1016 N+/cm2離子注入復(fù)以1.0 mmol/L NaN3處理的葉綠素突變頻率依次為2.96%、316%、1.24%和1.87%（M2代苗計(jì)），比對(duì)應(yīng)劑量下2種誘變劑單獨(dú)處理的葉綠素突變頻率之和1.89%、2.22%、123%和1.39%要高[10]。

航天搭載促進(jìn)有絲分裂，復(fù)合處理同航天搭載相比，甘藍(lán)型油菜種子的根尖細(xì)胞對(duì)有絲分裂有抑制效應(yīng)。同時(shí)，復(fù)合處理與2個(gè)單處理相比，可使多數(shù)甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生較高頻率的染色體畸變[11]。

2.1.3復(fù)合處理和單一處理誘變效應(yīng)相當(dāng)。

為篩選抗咪唑乙煙酸水稻，進(jìn)行了水稻種子敏感性檢測(cè)以確定篩選濃度。應(yīng)用紫外線、NaN3及復(fù)合誘變對(duì)種子進(jìn)行誘變篩選。結(jié)果表明，抗性篩選的適宜藥劑濃度為0.3 mL/L；在此濃度下，經(jīng)75 W紫外燈照射1、2、3 h的種子未篩選出抗性植株；種子經(jīng)不同濃度、時(shí)間NaN3處理后篩選出抗性植株，以NaN3誘變劑量為4 mmol/L×2 h時(shí)抗性比率最高，出苗率為7.14%；相比NaN3誘變，復(fù)合誘變的種子并沒(méi)有顯著不同。將篩選出的植株苗期噴5 mL/L咪唑乙煙酸，篩選出4株對(duì)咪唑乙煙酸有抗性的水稻植株[12]。

2.2誘變效應(yīng)

2.2.1誘變品種。

作物誘變的最終目標(biāo)是培育出性狀優(yōu)良的作物新品種。利用NaN3誘變，提高作物的突變頻率，已培育出一些新類(lèi)型、新性狀的作物品種。

以NaN3為誘變劑，誘變處理澳大利亞Au1990sp紫甘薯胚性細(xì)胞團(tuán)，獲得99個(gè)變異株系，從中篩選出3個(gè)高產(chǎn)株系，編號(hào)為CA06、CA11和CA17。3個(gè)高產(chǎn)株系產(chǎn)量分別達(dá)43.98、40.03和43.84 t/hm2，而對(duì)照組Au1990sp產(chǎn)量?jī)H為4.95 t/hm2。對(duì)高產(chǎn)株系進(jìn)行12年的連續(xù)篩選，選育出紫薯新品種甬紫薯1號(hào)，2012年12月通過(guò)浙江省審定[13]。

采用NaN3與甲基磺酸乙酯（EMS）復(fù)合誘變中翼1號(hào)種子，經(jīng)過(guò)6代連續(xù)選育，育成了四棱豆新品種湘棱豆3號(hào)，2010年10月通過(guò)湖南省審定。湘棱豆3號(hào)中早熟，不易纖維化并且耐熱，抗根腐病、果腐病等病害，一般嫩莢產(chǎn)量為14.8 t/hm2[14]。

2.2.2抗逆性狀。

NaN3誘變是作物提高抗逆性的有效途徑。NaN3誘變處理，可以有效改良作物的抗鹽、抗旱、抗寒和抗病蟲(chóng)害等性狀。

2.2.2.1抗旱性。

干旱缺水是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴(yán)重問(wèn)題，也是制約我國(guó)農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素。由于降水量不足或降水模式改變而造成的干旱在眾多非生物脅迫中是最具有破壞性的，同時(shí)也是限制作物產(chǎn)量的一個(gè)重要影響因素。選育抗旱性強(qiáng)、具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的品種（ 系）使之適應(yīng)干旱環(huán)境條件，是解決作物抗旱性的重要途徑。抗旱育種的關(guān)鍵是抗旱種質(zhì)材料的創(chuàng)制，化學(xué)誘變是創(chuàng)制抗旱種質(zhì)的有效途徑。

NaN3誘變玉米愈傷組織，獲得22個(gè)再生植株株系，對(duì)再生植株株系進(jìn)行耐旱性鑒定，篩選出5個(gè)耐旱性高于未誘變對(duì)照的誘變株系，其中1個(gè)株系的耐旱性接近于耐旱自交系81565[15]。

利用NaN3和γ射線復(fù)合誘變玉米自交系18-599，獲得了一個(gè)抗旱性明顯提高的變異株系18-599M。在人工和自然干旱脅迫條件下，對(duì)18-599M的M2～M4代材料進(jìn)行抗旱性評(píng)估，發(fā)現(xiàn)18-599M的抗旱性均顯著高于18-599[16]。

2.2.2.2抗鹽性。

土壤鹽漬化對(duì)農(nóng)業(yè)的影響是一個(gè)全球性的問(wèn)題，全球20%的耕地和近50%的灌溉土地都受到不同程度的鹽害威脅，所以植物抗鹽育種一直是研究熱點(diǎn)。雖然采用傳統(tǒng)的方法選育耐鹽堿的植物品種簡(jiǎn)便可行，但抗鹽種質(zhì)缺乏限制了傳統(tǒng)育種方法的利用。利用NaN3誘變谷子、小麥和鳳尾雞冠花已獲得了抗鹽性顯著提高的種質(zhì)。

谷子幼穗和小冠花子葉的愈傷組織經(jīng)NaN3誘變后，分別以NaC1和脯氨酸類(lèi)似物L(fēng)-羥基脯氨酸（Hyp）為篩選劑，獲得了耐鹽性較對(duì)照相比明顯增強(qiáng)的細(xì)胞系。對(duì)后代分析后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照系相比，生理生化特性方面耐鹽系抗氧化系統(tǒng)SOD和POD酶活性顯著提高，SDS-PAGE凝膠電泳分析，耐鹽系可溶性蛋白的質(zhì)和量都發(fā)生了顯著的變化；分子水平上，RAPD多態(tài)分析發(fā)現(xiàn)耐鹽變異體較對(duì)照存在分子標(biāo)記多態(tài)性，表明了抗性系基因組DNA分子水平發(fā)生了變化[17-18]。

從NaN3誘變小麥M3代中，篩選獲得了耐高滲能力提高的突變材料422。研究發(fā)現(xiàn)，該突變材料葉片中鉀積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型材料，并且耐鹽能力也顯著高于野生型材料。從而證實(shí)了鉀對(duì)植物耐受力起積極影響的假設(shè)[19]。

利用RAPD技術(shù)對(duì)鳳尾雞冠花耐鹽突變體進(jìn)行遺傳特性分析，發(fā)現(xiàn)耐鹽突變體與對(duì)照相比，9個(gè)引物出現(xiàn)差異條帶，變異率為31.73%，說(shuō)明NaN3能有效誘導(dǎo)鳳尾雞冠花的基因變異[20]。

2.2.2.3抗寒性。

低溫是限制作物生長(zhǎng)和分布的一種非生物脅迫因子。低溫寒害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，受害面積廣，損失大。雖然作物本身具有一定的抗寒性，但是不同作物種類(lèi)和品種有不同的抗寒性，不同器官的抗寒性也不一樣。誘變是提高植物抗寒性的有效途徑，這對(duì)于避免和減少寒害損失有重要意義。

將草原2號(hào)、準(zhǔn)格爾、龍牧801這3個(gè)苜蓿品種的幼莖愈傷組織經(jīng)NaN3誘變處理后經(jīng)-7 ℃低溫篩選，3個(gè)品種均獲得了抗寒性顯著高于對(duì)照的愈傷組織。通過(guò)測(cè)定變異愈傷組織的可溶性糖含量、過(guò)氧化物酶活性以及脯氨酸含量等生理生化指標(biāo)，驗(yàn)證了3個(gè)苜蓿品種誘變處理后愈傷組織的抗寒性明顯高于對(duì)照[21-22]。

2.2.2.4抗病蟲(chóng)害。

在肯尼亞，寄生雜草獨(dú)腳金嚴(yán)重威脅主要作物玉米和高粱的生產(chǎn)。埃格頓大學(xué)研究者利用NaN3誘變處理玉米，獲得了能夠抑制獨(dú)腳金種子萌發(fā)和寄生現(xiàn)象發(fā)生的玉米株系。誘變獲得的這些株系材料可以用于選育抗獨(dú)腳金的玉米品種，另外在這些株系中K9908、K9910和K9911有較高的抗性，這些材料可以用于研究玉米抗獨(dú)腳金的機(jī)理，挖掘控制抗獨(dú)腳金的相關(guān)基因[23]。

3個(gè)北美啤酒大麥品種，經(jīng)NaN3誘變處理后獲得了不同抗性的抗霉病植株。在抗病植株中，URS1和PRU1這2個(gè)突變株，表現(xiàn)出了對(duì)霉病的完全抗性，并且該性狀由mlo位點(diǎn)的2個(gè)新等位基因mlo31和mlo32控制。突變株URS2，是一個(gè)不完全抗性株，是由一個(gè)顯性基因控制的，但該基因不是Mla位點(diǎn)的等位基因[24]。

2.2.3矮化變異。

矮稈高產(chǎn)雜交小麥帶來(lái)了第一次綠色革命，矮稈性狀是很多作物高產(chǎn)的保障，誘變可以誘導(dǎo)作物產(chǎn)生矮化突變。矮稈材料具有抗倒伏和可實(shí)現(xiàn)密植的優(yōu)點(diǎn)，可以成為作物育種改良方向和研究高產(chǎn)作物的重要參考依據(jù)。

全妙華等[25]采用0.3%甲基磺酸乙酯（EMS）和0.325% NaN3復(fù)合誘變劑處理四棱豆種子，篩選獲得了矮化突變性狀。田間調(diào)查表明，矮化突變體的主蔓長(zhǎng)、一級(jí)分枝數(shù)、百粒重等主要農(nóng)藝性狀與對(duì)照存在明顯差異。

NaN3處理大豆品種黑農(nóng)37、抗線2號(hào)、東農(nóng)42號(hào)、東農(nóng)92-07，后代株系中出現(xiàn)了矮化表型[26]。

用NaN3處理大豆種子，在M1植株群體中篩選出許多突變體，其中1株突變體為矮稈HK808，株高為原品種東農(nóng)42的50%，HK808已經(jīng)穩(wěn)定遺傳。該突變體的培育將為大豆基因結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)以及“窄行矮稈密植”模式的研究奠定基礎(chǔ)[27]。

2.2.4雄性不育突變體。

雄性不育系是實(shí)現(xiàn)雜交種規(guī)模化制種和商業(yè)化利用的必要條件，然而自然界中可用雄性不育系資源較少，從已有的育種材料中篩選獲得的難度較大。利用NaN3可以有效誘導(dǎo)不同作物產(chǎn)生雄性不育突變體，供育種所用。

NaN3誘變處理大豆品種南農(nóng)86-4，獲得了雄性不育突變體NJS-1H。該突變體從減數(shù)分裂到花粉粒發(fā)育成熟都有敗育發(fā)生，但大量敗育主要發(fā)生在減數(shù)分裂階段。對(duì)突變體后代育性分離株系及株系群的遺傳分析，發(fā)現(xiàn)雄性不育性狀受1對(duì)隱性核基因控制[28]。

四棱豆種子經(jīng)0.3%甲基磺酸乙酯（EMS）和0.325%NaN3復(fù)合誘變處理后，獲得了雄性不育突變體。突變體與野生型可由9條ISSR引物明顯區(qū)分，表明該突變性狀是由基因突變引起的。通過(guò)與野生型進(jìn)行表型比較發(fā)現(xiàn)，該突變體在株高、葉色、莖稈形狀、莖稈顏色等方面與野生型無(wú)明顯差異[29]。

60Coγ射線和NaN3復(fù)合處理玉米愈傷組織，從M1代株系中篩選出了1個(gè)細(xì)胞核隱性單基因控制的孢子體雄性不育株[30]。

2.2.5抗草甘膦。

抗除草劑作物，可以減少作物生產(chǎn)中的勞動(dòng)力投入，降低生產(chǎn)成本，提高農(nóng)民收入。但自然界中能夠抗除草劑的作物類(lèi)型很少，能同時(shí)抗多種除草劑的作物就更少見(jiàn)，對(duì)某種高效除草劑的抗性也往往僅限于少數(shù)幾種作物。誘變能夠誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗除草劑突變性狀，是創(chuàng)制抗除草劑作物的有效途徑。

5 mmol/L NaN3誘變處理綏農(nóng)10和黑農(nóng)446的大豆種子，利用3葉期噴灑1.31 kg/hm2草甘膦的方法進(jìn)行抗草甘膦突變株篩選，篩選獲得40株抗草甘膦突變株，對(duì)突變株M4代進(jìn)行鑒定，抗草甘膦特性可以穩(wěn)定遺傳[31]。

應(yīng)用紫外線和NaN3分別對(duì)水稻種子和小麥進(jìn)行誘變，在含有不同濃度草甘膦的溶液中進(jìn)行種子篩選。分別篩選出4株抗草甘膦的水稻植株和4株抗草甘膦的小麥植株[32-33]。

2.2.6早熟性狀。

早熟性狀是作物豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和品質(zhì)的保障。NaN3誘變處理不同作物，可以有效改良作物的早熟性狀。

應(yīng)用CO2激光與NaN3、γ射線復(fù)合處理遲熟晚糯浙糯2號(hào)水稻種子，早熟突變和矮稈突變頻率顯著提高，表現(xiàn)出明顯的累加效應(yīng)，γ射線加激光處理的早熟突變頻率達(dá)135%，NaN3加激光處理的矮稈突變頻率達(dá)3.11%，是較為理想的誘變方法[7]。

沈法富等[34]將0.5 mmol/L的NaN3經(jīng)花粉管注入到完成受精的冀棉6號(hào)的胚囊中，從變異后代中篩選獲得了一個(gè)較冀棉6號(hào)熟期早25 d的早熟品系，且該性狀可以穩(wěn)定遺傳。

3展望

誘變技術(shù)和基因工程技術(shù)是人工創(chuàng)造變異的主要技術(shù)手段。但相較基因工程技術(shù)，誘變技術(shù)不易受作物種類(lèi)、基因型等影響，幾乎可以應(yīng)用于所有的作物突變的創(chuàng)制；而且誘變技術(shù)易掌握，周期短，可以高效誘發(fā)突變。其中化學(xué)誘變比物理誘變更安全、更經(jīng)濟(jì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求更低，應(yīng)用更廣泛。

雖然化學(xué)誘變技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于作物的性狀改良，但突變的無(wú)方向性增加了后代篩選的難度，限制了化學(xué)誘變育種效率。隨著分子水平檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)誘變技術(shù)和分子輔助選擇技術(shù)相結(jié)合，在分子水平上檢測(cè)突變的發(fā)生，有效提高了突變選擇的準(zhǔn)確性和效率，加速了作物性狀改良的進(jìn)程。今后隨著測(cè)序技術(shù)和分子標(biāo)記的進(jìn)一步發(fā)展，突變的檢測(cè)方法將會(huì)越來(lái)越簡(jiǎn)便有效，從而推動(dòng)誘變技術(shù)的進(jìn)步，拓寬誘變技術(shù)在作物性狀改良方面的應(yīng)用。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

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