鴿源鼠傷寒沙門菌的分離鑒定及致病性分析

楊夢(mèng)林,鄭世奇,彭 凱,王 瑋,黃燕華,3*,彭 杰*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院,廣州 510225;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,廣東省畜禽 育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640; 3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

沙門菌在全世界廣泛分布,自1885年沙門菌首次被分離后,截至目前為止,已發(fā)現(xiàn)的血清型已經(jīng)超過(guò)2 600種[1]。鴿沙門菌病是肉鴿養(yǎng)殖業(yè)中常見的細(xì)菌病之一,主要病原菌為鼠傷寒沙門菌,通過(guò)消化道、呼吸道等途徑傳播,癥狀表現(xiàn)為精神狀態(tài)萎靡、羽毛凌亂、下痢、行為失常等。被感染的種鴿能夠通過(guò)垂直傳播將細(xì)菌傳遞給種蛋,引起種蛋壞死,降低孵化率,還能通過(guò)哺乳等方式感染乳鴿,引起乳鴿生長(zhǎng)速度減慢甚至死亡[2]。此外,沙門菌作為人畜共患病原菌,能夠通過(guò)污染鴿的加工產(chǎn)品傳播給人類和動(dòng)物,對(duì)公共衛(wèi)生安全造成威脅。目前抗生素濫用情況較為嚴(yán)重,造成了細(xì)菌的耐藥性形成速度加快[3],因此了解沙門菌的耐藥性對(duì)于科學(xué)用藥有重要意義。

廣東某地區(qū)規(guī)?；怿濔B(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)肉鴿下痢、消瘦、精神異常、關(guān)節(jié)腫大等癥狀,臨床觀察發(fā)現(xiàn)疑似感染鴿沙門菌。試驗(yàn)采集病死鴿病變組織,進(jìn)行細(xì)菌分離、純化、鑒定、耐藥性分析、耐藥基因和毒力基因檢測(cè)并建立感染嚙齒動(dòng)物模型,分析沙門菌的毒力和致病性,以期為沙門菌病防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料收集

從廣東某地區(qū)三個(gè)大規(guī)模肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)收集72只病死鴿,根據(jù)病鴿臨床癥狀在無(wú)菌條件下分別采集36份肝、23份脾、13份膝關(guān)節(jié)樣品,共計(jì)72份待檢測(cè)樣本。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

麥康凱培養(yǎng)基、XLD瓊脂、SS瓊脂、LB培養(yǎng)基、生化鑒定管購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品;藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;2×F8 Master Mix購(gòu)自艾德萊有限公司;DNA標(biāo)準(zhǔn) DL2000,核酸染料E×Red(10 000×)購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司產(chǎn)品;沙門菌屬診斷血清試劑盒購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 病原菌分離與鑒定

在無(wú)菌條件下將72份病變組織進(jìn)行研磨,先后接種于XLD瓊脂、麥康凱瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基分離純化,記錄菌落形態(tài)和顏色并進(jìn)行革蘭染色和鏡檢。對(duì)分離菌進(jìn)行生化鑒定以及生長(zhǎng)曲線觀察;采用沙門菌屬診斷血清,觀察分離菌與O價(jià)血清凝集情況;鼠傷寒沙門菌特異性STM4497基因PCR鑒定[4]及16S rRNA鑒定[5],擴(kuò)增片段送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast序列相似性對(duì)比分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS-2018) 描述的K-B法的標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)抑菌圈直徑進(jìn)行判定分離菌株的耐藥情況。藥敏試驗(yàn)用藥包括氨芐西林、阿莫西林等20種藥物。

1.5 耐藥基因和毒力基因檢測(cè)

試驗(yàn)挑取單菌落溶解于裝有50 μL無(wú)菌水的EP管中,振蕩混勻后作DNA模板,檢測(cè)耐藥基因(tetA、tetB、sul-11、aphA3、aacC4、aadAF、aacC2、qnrA、qnrB、Aac(6′)-Ib、catI、floR、cmlA、blaTEM、blaSHV)[6-14]和毒力基因(mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、stn、fliC、fimA、avrA、invH、sopA、virK)[15-18]。

1.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將6周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組,每組6只,選取攜帶毒力基因數(shù)量最多的致病菌分別以103、105、107、109CFU·mL-1濃度的攻毒劑量處理試驗(yàn)組,每只灌服0.2 mL,設(shè)置陰性對(duì)照組,以PBS代替菌液,每只0.2 mL,僅第1日灌服,飼養(yǎng)期為6 d,試驗(yàn)期結(jié)束后觀察小鼠器官病變。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌分離鑒定

本研究在72份樣本共分離鑒定出12株病原菌,在XLD培養(yǎng)基均長(zhǎng)出邊緣整齊、圓形粉紅色菌落,中心呈黑色(圖1A);在麥康凱培養(yǎng)基均長(zhǎng)出表面光滑、圓形半透明灰白色菌落(圖1B);在SS瓊脂均長(zhǎng)出無(wú)色半透明狀菌落,中心呈黑色(圖1C)。鏡檢觀察到兩端鈍圓、沒有芽胞和莢膜的革蘭陰性桿狀菌(圖1D)。生化鑒定結(jié)果均符合沙門菌特性,血清型鑒定結(jié)果顯示沙門菌A～F多價(jià)O血清和沙門菌O4單價(jià)血清因子與12株分離菌發(fā)生凝集反應(yīng),鼠傷寒沙門菌特異性序列STM4497經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條接近523 bp DNA目的條帶,并將16S rRNA測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析對(duì)比并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1E),綜上,說(shuō)明12株分離菌均屬于鼠傷寒沙門菌。

2.2 分離菌耐藥性檢測(cè)

藥敏結(jié)果顯示,12株菌分離菌對(duì)恩諾沙星、甲氧芐啶、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、氯霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻吩、美羅培南、頭孢曲松耐藥率為0.0%,對(duì)卡那霉素、呋喃妥因、頭孢噻肟、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥率為8.3%～33.3%,對(duì)多西環(huán)素、米諾環(huán)素的耐藥率為58.3%～83.3%,對(duì)萘啶酸和利福平耐藥率為100.0%。

2.3 分離菌耐藥基因和毒力基因檢測(cè)

12株分離菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示,tetA攜帶率為58.3%,sul-11攜帶率為41.7%,其他耐藥基因未檢出,結(jié)合“2.2”藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),四環(huán)素類耐藥基因與其耐藥表型符合率100%,但磺胺類耐藥基因與耐藥表型符合率為0%。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示,mgtC、bcfA、spvA、spvD、spvR、stn、avrA、invH、sopA攜帶率為100%,sseL、spvC、fliC攜帶率為91.7%,mogA、virK基因攜帶率為83.3%,araB為75.0%,spvB為66.7%,fimA為58.3%,說(shuō)明該地區(qū)流行沙門菌毒力基因攜帶較多,詳見表1。

2.4 分離菌致病性研究

試驗(yàn)隨機(jī)選取攜帶檢測(cè)毒力基因最多的1株分離菌進(jìn)行攻毒小鼠試驗(yàn),結(jié)果顯示,隨著灌菌濃度增大,小鼠體重和采食量顯著下降(圖2A、B),脾、肝腫大,結(jié)腸長(zhǎng)度縮減(圖2C、D、E)。觀察空腸HE切片發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌引起絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值下降(圖2F),杯狀細(xì)胞逐漸減少(圖2G、I);觀察肝HE切片發(fā)現(xiàn)大量免疫細(xì)胞匯集肝,并且肝枯否細(xì)胞(Kupffer cell)數(shù)目逐漸增加(圖2H、圖3)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)從樣本中分離出的12株致病菌均為鼠傷寒沙門菌,除本研究外,在多地報(bào)告中也指出鴿沙門菌病是由鼠傷寒沙門菌感染引起,這提示了鴿子對(duì)鼠傷寒沙門菌易感。細(xì)菌耐藥性形成與抗生素產(chǎn)生的環(huán)境壓力有著緊密聯(lián)系,細(xì)菌能夠通過(guò)整合子、質(zhì)粒等從外界獲取抗性基因,同時(shí)還能夠通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等多種可移動(dòng)原件發(fā)生水平傳播[3,19-20]。試驗(yàn)檢測(cè)出5株菌具有磺胺類耐藥基因sul-11,但對(duì)磺胺類藥物卻保持高度敏感,與相關(guān)報(bào)道中磺胺類耐藥基因sul-11與磺胺異噁唑耐藥表型符合程度較高[21]具有差異性,這可能與本研究使用的藥物為甲氧芐啶和復(fù)方新諾明有關(guān),不同的藥物作用機(jī)制存在差異,此外,sul-11基因能夠表達(dá)出具有磺胺類藥物抗性的二氫蝶酸合成酶,使細(xì)菌的生長(zhǎng)不受磺胺類藥物影響。但在細(xì)菌內(nèi)部由于sul-11基因存在多種類型的質(zhì)粒中[22-24],其表達(dá)水平以及作用機(jī)制并不清晰,需要進(jìn)一步探究。除此之外,部分菌種對(duì)氨基糖苷類和喹諾酮類具有耐藥性,但并未檢出氨基糖苷類和喹諾酮類耐藥基因,可能與本研究檢測(cè)耐藥基因種類不全有關(guān),亦或者產(chǎn)生了新的耐藥基因。

細(xì)菌是通過(guò)多個(gè)毒力因子之間的協(xié)同作用對(duì)機(jī)體器官造成炎性損傷的,因此檢測(cè)毒力基因攜帶量有利于評(píng)估沙門菌致病能力。本研究發(fā)現(xiàn),毒力島基因ssel、mogA、mgtC、bcfA、araB檢出率高于75.0%,毒力質(zhì)?；?、腸毒素毒力基因、鞭毛基因以及其他毒力基因檢出率均高于66.0%,其中11株菌含有sseL毒力基因,在諸多研究中發(fā)現(xiàn),攜帶毒力島基因sseL的沙門菌毒性更強(qiáng),沙門菌分泌的sseL蛋白能夠抑制機(jī)體炎癥反應(yīng),并且還能損傷吞噬細(xì)胞,有利于沙門菌逃逸[25-26]。除此之外,還有magtC、avrA、spvB、spvC、sopA等主要毒力因子[27],在本試驗(yàn)分離菌中攜帶率也較高,說(shuō)明該地區(qū)沙門菌的致病性較強(qiáng)。

在動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)灌服致病菌濃度高于105CFU·mL-1時(shí),小鼠空腸絨隱比及杯狀細(xì)胞數(shù)目隨著灌菌濃度升高逐漸下降。杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白是腸道機(jī)械屏障的重要組成部分,當(dāng)沙門菌定植于腸道后,毒力島SPI-1和SPI-2向腸上皮細(xì)胞輸送效應(yīng)蛋白,引起腸上皮細(xì)胞損傷,破壞腸道屏障的完整性[28-31],研究結(jié)果說(shuō)明沙門菌對(duì)腸道吸收功能和屏障功能具有負(fù)面影響。除此之外,研究發(fā)現(xiàn)隨著灌服致病菌濃度升高,肝臟中枯否細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,有研究指出革蘭陰性菌細(xì)胞壁組分脂多糖能夠活化枯否細(xì)胞,使其炎癥因子分泌增加,引起其他免疫細(xì)胞向肝臟聚集,共同清除血液中的細(xì)菌[32],然而這個(gè)過(guò)程是否有枯否細(xì)胞前體細(xì)胞募集進(jìn)入肝臟發(fā)生分化增殖這一機(jī)制并不清晰,本研究枯否細(xì)胞數(shù)量增加可能與上述過(guò)程有關(guān),此機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

成功分離出12株鼠傷寒沙門菌,通過(guò)藥敏測(cè)試、耐藥和毒力基因檢測(cè)以及6周齡小鼠致病性研究發(fā)現(xiàn)分離菌均出現(xiàn)多重耐藥,并且毒力基因攜帶量較高,致病性強(qiáng),建議在該地區(qū)治療鴿沙門菌病中使用甲氧芐啶、復(fù)方新諾明等高敏感藥物,同時(shí)要提高公共衛(wèi)生安全意識(shí),注重食品安全,避免向人群傳播。