阿司匹林與華法林聯(lián)用在大鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究

周峰++趙青

【摘 要】目的：研究阿司匹林與華法林聯(lián)用在大鼠體內(nèi)的療效。方法：取成年SD雄性大鼠60只，體重180-200g之間，隨機(jī)分為三組：空白組、單用華法林組、阿司匹林與華法林聯(lián)用組。三組均灌胃7天，空白組灌服生理鹽水，單用華法林組灌服華法林（0.2mg/kg），聯(lián)用組灌服阿司匹林（10mg/kg）+華法林（0.2mg/kg）。七天后腹主動(dòng)脈采血法測(cè)定三個(gè)藥效學(xué)指標(biāo)：血小板聚集抑制率、凝血酶原時(shí)間和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值、血小板胞內(nèi)[Ca2+]i。結(jié)果：SD大鼠灌胃7天后腹主動(dòng)脈采血測(cè)定，血小板聚集功能：空白組血小板聚集抑制率0.5%，單用華法林組血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+華法林組血小板聚集抑制率68%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；凝血酶原時(shí)間和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值：空白組凝血酶原時(shí)間16.7s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.12；單用華法林組凝血酶原時(shí)間20.1s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.58；阿司匹林+華法林組凝血酶原時(shí)間23.8s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.92，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。血小板胞內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定：空白組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i （67.7±12.9）nmol/L；單用華法林組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i（54.5±11.4）nmol/L；阿司匹林+華法林組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i（43.7±10.9）nmol/L，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。結(jié)論：阿司匹林與華法林聯(lián)用抗凝作用優(yōu)于單用華法林組，可以用于凝血功能嚴(yán)重亢進(jìn)，單用華法林無(wú)法有效控制的患者中，可以取得較好的抗凝效果，但是同時(shí)應(yīng)注意兩藥聯(lián)用后的出血傾向，在實(shí)際應(yīng)用中視具體情況而選擇藥物配伍。

【關(guān)鍵詞】阿司匹林 華法林 聯(lián)用

1 資料與方法

1.1 一般資料

取成年SD雄性大鼠60只，體重180-200g之間，隨機(jī)分為三組：空白組、單用華法林組、阿司匹林與華法林聯(lián)用組。

1.2 方法

三組均灌胃7天，空白組灌服生理鹽水，單用華法林組灌服華法林（0.2mg/kg）），聯(lián)用組灌服阿司匹林（10mg/kg）+華法林（0.2mg/kg）。七天后腹主動(dòng)脈采血法測(cè)定三個(gè)藥效學(xué)指標(biāo)：血小板聚集抑制率、凝血酶原時(shí)間和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值、血小板胞內(nèi)[Ca2+]i。

1.2.1 血小板聚集功能

（1）富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP）的制備。將灌胃后大鼠抽血于3.8%枸櫞酸鈉抗凝管內(nèi)，800rpm離心6min得上清液即為富血小板血漿（platelet-rich plasma， PRP），剩余血液繼續(xù)離心2000rpm×10min得貧血小板血漿（platelet-poor plasma， PPP），用PPP調(diào)PRP血小板數(shù)為3×108/ml。

（2）Born比濁法測(cè)定血小板聚集功能于比濁管內(nèi)加入500μl PPP調(diào)零（100%），同樣取500μlPRP，放入另一比濁管中，37℃預(yù)熱2min，加入誘導(dǎo)劑ADP，在電磁攪拌下觀察并記錄5min內(nèi)血小板聚集情況，記錄血小板最大聚集率。按公式計(jì)算聚集抑制率：血小板聚集抑制率（%）=（對(duì)照組血小板聚集率—給藥組血小板聚集率）/正常對(duì)照血小板聚集率×100%。

1.2.2 凝血酶原時(shí)間的測(cè)定和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值的計(jì)算

將冷凍保存的血漿解凍，取0.1 mL，37℃水浴預(yù)熱3分鐘，迅速加入預(yù)熱的PT試劑0.2 mL，混勻后立即計(jì)時(shí)，記錄凝血絲出現(xiàn)的時(shí)間，每個(gè)血樣重復(fù)測(cè)定兩次，兩次測(cè)定差值應(yīng)在2S之內(nèi)，取平均值，即為PT值。另取未用藥大鼠6只，測(cè)得其血漿PT值的均值為s，作為正常值（PTnor），與用藥大鼠的PT實(shí)驗(yàn)值（PTexp）一同用于INR的計(jì)算：INR=（PTexp/PTnor）ISI，其中 ISI（International Sensitive Index）為國(guó)際敏感度指數(shù)，其值為1.85。

1.2.3 血小板胞內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定

（1）洗滌血小板懸液的制備。取1.1項(xiàng)方法制備的PRP，加1/4體積的ACD緩沖液（44mM枸櫞酸鈉，20mM檸檬酸，74mM葡萄糖，pH5.0），離心得片狀沉淀，用洗滌液（113mM NaCl，4mM KCl，24mM NaH2PO4，4mM Na2HPO4，0.2mM EGTA，0.1%葡萄糖，pH6.1）洗滌，離心1500rpm×10min，Hepes-Tyrode液（134 mM NaCl，12 mM NaHCO3，0.34 mM NaH2PO4，2.9 mM KCl，1 mM CaCl2，0.8 mM MgCl2，5 mM HEPES，5 mM 葡萄糖 pH 7.4）懸浮，調(diào)整血小板密度為2×108/ml。

（2）負(fù)載血小板懸液（Fura-2 platelet supension，F(xiàn)PS）的制備。將血小板懸液加入Fura-2/AM（熒光染料），使其終濃度為5μM，37℃恒溫避光溫育45min，使Fura-2/AM載入細(xì)胞內(nèi)，將已負(fù)載的血小板懸液離心2000rpm×10min，去掉上清液，用洗滌液洗滌2遍后用Hepes-Tyrode液重新懸浮。調(diào)整血小板數(shù)至2×108/ml，測(cè)定熒光強(qiáng)度。

（3）血小板胞內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定。應(yīng)用島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)作波長(zhǎng)掃描，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）于500nm，掃描負(fù)載血小板懸液的激發(fā)波長(zhǎng)，如激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）波峰由380nm移至340nm，表明Fura-2/AM已負(fù)載酯解進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可作[Ca2+]i熒光測(cè)定。測(cè)定時(shí)Em為500nm（波寬10nm），Ex分別為340nm和380n（波寬5nm），波長(zhǎng)變換時(shí)間間隔為2s。按以上參數(shù)執(zhí)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，測(cè)定分組：分為靜息態(tài)和激活態(tài)（加入PAF，終濃度0.75ug/ml），靜息態(tài)和激活態(tài)均包括0.9%氯化鈉注射液組（NS組）和給藥組。應(yīng)用熒光比值法連續(xù)描記靜息態(tài)和激活態(tài)的熒光強(qiáng)度比值（F340/F380）變化以及最大熒光強(qiáng)度比值（Rmax），最小熒光強(qiáng)度比值（Rmin）。

鈣離子濃度計(jì)算基本公式：

[Ca2+]i=Kd·[（R-Rmax）/（Rmin-R）]·（S1/S2）?！补街蠯d是Fura-2與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，37℃時(shí)為224nmol/L；Rmax是胞外游離鈣為1mmol/L時(shí)，加入Triton X-100（10%）破膜劑使Fura-2被Ca2+全部飽和時(shí)所測(cè)得的熒光比值；Rmin是Fura-2所結(jié)合Ca2+被EGTA全部螯合時(shí)的熒光比值。S1和S2分別為零Ca2+和Ca2+飽和時(shí)，在Ex 380nm測(cè)得的熒光強(qiáng)度?！?/p>

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件spss18.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血小板聚集功能

SD大鼠灌胃7天后腹主動(dòng)脈采血測(cè)血小板聚集功能，其中空白組血小板聚集抑制率0.5%，單用華法林組血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+華法林組血小板聚集抑制率58%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

2.2 凝血酶原時(shí)間及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值

SD大鼠灌胃7天后腹主動(dòng)脈采血測(cè)凝血酶原時(shí)間和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值，其中空白組凝血酶原時(shí)間16.7s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.04；單用華法林組凝血酶原時(shí)間20.1s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.42；阿司匹林+華法林組凝血酶原時(shí)間23.8s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.67，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

2.3 血小板胞內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定

SD大鼠灌胃7天后腹主動(dòng)脈采血測(cè)凝血酶原時(shí)間和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值，其中空白組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i （57.6±13.1）nmol/L；單用華法林組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i（43.4±12.5）nmol/L；阿司匹林+華法林組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i（32.6±11.3）nmol/L，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。如表1所示。

3 討論

3.1 華法林

華法林影響外源性凝血因子VII的活性，口服華法林后通過(guò)監(jiān)測(cè)其對(duì)外源性凝血系統(tǒng)的影響（凝血酶原時(shí)間，PT）來(lái)調(diào)整劑量。臨床使用標(biāo)準(zhǔn)化PT，即國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）來(lái)調(diào)整華法林的用藥劑量。INR=PTRISI，其中ISI為國(guó)際敏感指數(shù)，代表凝血活酶的促凝活（敏感性）；PTR為受試者PT與正常血漿PT的比值。

3.2 阿司匹林

ATC研究對(duì)不同劑量的阿司匹林在預(yù)防嚴(yán)重心腦血管事件方面的療效進(jìn)行了薈萃分析，證實(shí)阿司匹林的長(zhǎng)期使用最佳劑量為75～150mg/d[1]，增加阿司匹林的劑量并不能增強(qiáng)其抗血小板的功效而不良反應(yīng)增加，劑量過(guò)?。?lt;75mg/d）時(shí)，療效不確定。長(zhǎng)期服用小劑量（75～150mg/d）阿司匹林，能夠獲得相對(duì)最佳的耐受性和療效。在急性期，為了快速抑制血小板聚集，應(yīng)該給予150～300rng負(fù)荷劑量，腸溶片劑應(yīng)該嚼服。

3.3 阿司匹林與華法林聯(lián)用

從上文中得出的結(jié)果所示：SD大鼠灌胃7天后腹主動(dòng)脈采血測(cè)定，血小板聚集功能：空白組血小板聚集抑制率0.5%，單用華法林組血小板聚集抑制率23%，阿司匹林+華法林組血小板聚集抑制率58%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；凝血酶原時(shí)間和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值：空白組凝血酶原時(shí)間16.7s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.04；單用華法林組凝血酶原時(shí)間20.1s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.42；阿司匹林+華法林組凝血酶原時(shí)間23.8s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.67，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。血小板胞內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定：空白組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i （67.7±12.9）nmol/L；單用華法林組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i（54.5±11.4）nmol/L；阿司匹林+華法林組血小板胞內(nèi)[Ca2+]i（43.7±10.9）nmol/L，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。可見(jiàn)，阿司匹林與華法林聯(lián)用，在血小板抑制率，凝血酶原時(shí)間和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值及血小板胞內(nèi)Ca2+濃度方面，均優(yōu)于單用華法林組，兩要聯(lián)用使抗血小板作用與抗外源性凝血途徑作用結(jié)合，在臨床上可以發(fā)揮更強(qiáng)的抗凝作用，可以應(yīng)用于單用華法林無(wú)法控制的頑固性高凝狀態(tài)患者。但是血小板系統(tǒng)及凝血因子的功能同時(shí)被抑制，增加了用藥后的出血風(fēng)險(xiǎn)，從結(jié)果中可以看出，兩藥聯(lián)用后，凝血酶原時(shí)間顯著增加，血小板抑制率大幅上升，當(dāng)應(yīng)用于患者身上時(shí)，有可能導(dǎo)致患者由高凝狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟δ懿蛔?，引發(fā)出血，甚至危及生命[2]。從本文的結(jié)果中，我們可以得知，對(duì)于不同藥理的藥物配伍使用，應(yīng)當(dāng)結(jié)合具體情況，在使用過(guò)程中密切監(jiān)測(cè)患者血液系統(tǒng)指標(biāo)，以期達(dá)到在藥物的作用下，患者凝血指標(biāo)值基本保持在正常范圍內(nèi)。

阿司匹林與華法林的聯(lián)用已有多年的研究歷史，但是由于在臨床使用時(shí)無(wú)法把握好使用的比例和聯(lián)用時(shí)機(jī)、時(shí)間，導(dǎo)致兩藥聯(lián)用受到限制。只要正確的了解阿司匹林與華法林的藥理特性，密切監(jiān)測(cè)聯(lián)用時(shí)的血液學(xué)凝血系統(tǒng)指標(biāo)，兩藥的聯(lián)用必將成為各類凝血系統(tǒng)亢進(jìn)疾病的有效治療方式。

參考文獻(xiàn)：

[1]莫衛(wèi)民，景華，陳冰，等.心臟瓣膜置換病人口服華法林后的對(duì)映體藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，32（3）：52.

[2]陳修，陳維洲，曾貴云.心血管藥理學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社，2009：569.