離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎與仔魚(yú)的毒性

南平++燕帥國(guó)++王亞星++韓曉++張巖晨++杜啟艷++常重杰

摘要：為了研究離子液體[C16mim]Cl的生物毒性作用，以泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）胚胎和仔魚(yú)為受試動(dòng)物，分別以胚胎發(fā)育的囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和尾芽期4個(gè)發(fā)育時(shí)期以及孵出期和孵出3 d的仔魚(yú)作為處理的起始點(diǎn)進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨著[C16mim]Cl濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，泥鰍胚胎的孵化率逐漸下降，畸形率則在逐步升高；其中，剛孵出的仔魚(yú)24 h與48 h的半數(shù)致死濃度（LC50）及安全濃度（SC）分別為0.555、0.453、0.091 mg/L；孵出3 d的仔魚(yú)24 h與48 h的LC50及SC分別為0.444、0.273、0.031 mg/L。表明在較低劑量?jī)?nèi)，離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎及其仔魚(yú)的發(fā)育表現(xiàn)出明顯的致畸與致死作用，并且該毒性作用具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）；胚胎發(fā)育；仔魚(yú)；[C16mim]Cl；毒性

中圖分類號(hào)：S966.4：X52 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）08-1518-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.028

Study on the Toxicity Effect of [C16mim]Cl to Misgurnus anguillicaudatus

Embryos and Larvae

NAN Ping，YAN Shuai-guo，WANG Ya-xing，HAN Xiao，ZHANG Yan-chen，DU Qi-yan，CHANG Zhong-jie

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： The toxic effect of chloride-1-sixteen alkyl-3-methylimidazolium chinook（[C16mim]Cl） to the embryos and larvae of Misgurnus anguillicaudatus Cantor was studied. The M. anguillicaudatus were exposed to [C16mim]Cl from the beginning of different stages including the embryonic development of blastoderm， mid-gastrula， neurula and tail bud stage， and the larval of hatching period and 3 days after hatching. The results showed that the hatching rate of M. anguillicaudatus embryos decreased and the abnormality of M. anguillicaudatus embryos increased with the increase of[C16mim]Cl treatment time and treatment concentration； and a significant dose-response relationship was observed. The 24 h-LC50， 48 h-LC50 and SC of the newly hatched larvae were 0.555，0.453 and 0.091 mg/L respectively； whereas， the 24 h-LC50， 48 h-LC50 and SC of the 3-day-old larvae were 0.444， 0.273 and 0.031 mg/L. The above results showed that [C16mim]Cl had obvious teratogenic and lethal effect to the embryos and larvae of M. anguillicaudatus.

Key words： Misgurnus anguillicaudatus Cantor； embryonic development； larvae； [C16mim]Cl； toxicity

離子液體因其蒸汽壓非常小、不揮發(fā)，在使用、儲(chǔ)藏中不會(huì)蒸發(fā)散失，并且可以被循環(huán)利用，曾被認(rèn)為是理想的“綠色溶劑”[1]。但近年來(lái)的研究卻發(fā)現(xiàn)，有些離子液體具有較強(qiáng)的生物毒性[2，3]，例如疏水性離子液體在去除水中重金屬的過(guò)程中，形成的離子液體與重金屬混合物對(duì)青?；【亩拘砸笥谥亟饘俚亩拘?，并且離子液體相互混合物毒性大于離子液體與重金屬混合物的毒性[3]。此外，由于離子液體在研發(fā)、合成與使用的過(guò)程中，極有可能被釋放到環(huán)境中，尤其是水環(huán)境中，因而水生生物作為受試動(dòng)物所取得的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)離子液體生物毒性確認(rèn)具有較強(qiáng)的說(shuō)服力。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）屬鯉形目（Osteichthyes）鰍科（Cobitidae）泥鰍屬（Misgurnus Lecepede），是常見(jiàn)的淡水魚(yú)類。由于其分布較廣、個(gè)體較小、取材方便、飼養(yǎng)容易、對(duì)環(huán)境污染物反應(yīng)靈敏等特點(diǎn)，因而在毒性試驗(yàn)研究中，是理想的水生生物實(shí)驗(yàn)材料[3]。研究資料表明，魚(yú)類的胚胎是其整個(gè)生活史中對(duì)各種藥物最為敏感的時(shí)期，因此可以利用其胚胎期和仔魚(yú)期的敏感性來(lái)評(píng)價(jià)多種化合物及各種環(huán)境的毒性[4-7]。試驗(yàn)以泥鰍胚胎發(fā)育的4個(gè)時(shí)期（囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、尾芽期）以及孵出期和孵出3 d的仔魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，研究了離子液體對(duì)水生生物的毒性影響，以期為離子液體的合理研發(fā)與使用提供一定的參考，也為水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)及漁業(yè)用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試泥鰍購(gòu)自新鄉(xiāng)市鴻達(dá)市場(chǎng)，選擇大小相近、健康活潑、體重20～30 g、平均體長(zhǎng)13～17 cm的健壯泥鰍，試驗(yàn)前馴養(yǎng)一周，每天更換1次曝氣24 h的自來(lái)水。離子液體[C16mim]（氯化1-十六烷基-3-甲基咪唑，chloride-1-sixteen alkyl-3-methylimidazolium chinook，分子式：C20H39ClN2，分子量：343.01）購(gòu)自上海成捷化學(xué)有限公司，純度>99%；獸用絨毛膜促性腺激素（HCG）購(gòu)于新鄉(xiāng)市獸藥店。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的制備 在生殖季節(jié)，選取性成熟的雌、雄泥鰍各10尾，采用背部肌肉注射法注射獸用絨毛膜促性腺激素，其中雌魚(yú)為800 IU/尾；雄魚(yú)注射劑量減半。10～14 h后，輕壓雌鰍腹部，立即將卵收集于不同的培養(yǎng)皿中，干法受精[4]，獲得的受精卵備用。

1.2.2 處理 在前期預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置0.16、0.24、0.36、0.54、0.81 mg/L共5個(gè)[C16mim]Cl處理和1個(gè)空白對(duì)照處理，每處理均設(shè)3個(gè)平行樣，置于直徑12 cm的培養(yǎng)皿中（100個(gè)受精卵/培養(yǎng)皿）。在胚胎染毒組，以0.16～0.81 mg/L共5個(gè)[C16mim]Cl處理濃度的離子液體溶液（100 mL/培養(yǎng)皿），分別于囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和尾芽期開(kāi)始染毒處理；而對(duì)仔魚(yú)孵出期和卵黃吸收期同樣選擇0.16～0.81 mg/L共5個(gè)[C16mim]Cl處理（100 mL/培養(yǎng)皿）進(jìn)行染毒處理；每24 h更新其相應(yīng)的處理液、及時(shí)剔除死亡個(gè)體，并利用解剖顯微鏡連續(xù)觀察其發(fā)育狀況，并及時(shí)拍照、記錄。其中仔魚(yú)各處理在處理 48 h后終止試驗(yàn)（仔魚(yú)卵黃囊吸收完畢后，每天上、下午各投喂1次蛋黃）。根據(jù)文獻(xiàn)[7]計(jì)算出各處理的胚胎孵化率、畸形率及仔魚(yú)半數(shù)致死濃度，并推算出相應(yīng)的安全濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003程序處理，并用其制表和繪圖；運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎致畸癥狀表現(xiàn)、孵化率、畸形率的影響

離子液體[C16mim]Cl使泥鰍胚胎、仔魚(yú)致畸的癥狀表現(xiàn)見(jiàn)圖1，對(duì)泥鰍胚胎孵化率、畸形率的影響情況圖2。從圖1可見(jiàn)，胚胎的主要致畸癥狀表現(xiàn)為受精卵發(fā)育異常，如胚盤(pán)異常凸起（圖1-A）；胚盤(pán)下包異常（圖1-B）；胚體渾濁或自行解體（圖1-C）；卵黃吸收異常，如卵黃膨大、崩解等（圖1-D）。從圖2可見(jiàn)，隨著[C16mim]Cl離子液體濃度的增加，泥鰍胚胎孵化率下降，畸形率上升，具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。對(duì)4個(gè)胚胎發(fā)育期試驗(yàn)結(jié)果比較后，發(fā)現(xiàn)泥鰍胚胎經(jīng)相同濃度離子液體[C16mim]Cl處理后的孵化率由低到高依次為囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、尾芽期；除了囊胚期外，泥鰍胚胎的孵化率無(wú)明顯差異，即離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎影響的敏感性大致相同；只有囊胚期在處理后，胚胎的孵化率明顯下滑，即囊胚期處理可明顯降低泥鰍胚胎的孵化率，說(shuō)明該時(shí)期是離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍胚胎影響最敏感的時(shí)期，且對(duì)劑量具有一定的依賴關(guān)系。而在畸形率方面，劑量效應(yīng)關(guān)系更加明顯，其中在神經(jīng)胚期和尾芽期尤為突出。

2.2 離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍仔魚(yú)死亡率的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，在離子液體[C16mim]Cl處理1～2 h時(shí)，泥鰍仔魚(yú)活動(dòng)開(kāi)始加快。隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，仔魚(yú)表現(xiàn)出明顯的致畸癥狀，如彎體或彎尾等（圖1-E），且其攝食能力明顯降低，最終死亡。離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍仔魚(yú)死亡率的影響見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，[C16mim]Cl濃度越高，泥鰍仔魚(yú)的死亡率越大，具有一定的相關(guān)性。處于孵出期與孵出3 d后的仔魚(yú)對(duì)離子液體[C16mim]Cl的耐受性不同，兩者相比較，孵出期仔魚(yú)的24 h和48 h半數(shù)致死濃度及安全濃度分別為0.555、0.453、0.091 mg/L，孵出 3 d的仔魚(yú)其24 h和48 h半數(shù)致死濃度及其安全濃度分別為0.444、0.273、0.031 mg/L。由此可知，孵出期泥鰍仔魚(yú)對(duì)離子液體[C16mim]Cl的耐受性要強(qiáng)于孵出3 d的仔魚(yú)。

3 討論

離子液體因具有微乎其微的蒸氣壓、在使用過(guò)程中本身不會(huì)形成揮發(fā)性有機(jī)物及易于回收利用的特性而被眾多學(xué)者普遍認(rèn)為是“綠色溶劑”[1]。然而，近年來(lái)關(guān)于離子液體生物毒性研究的報(bào)道日趨增多[8，9]。研究發(fā)現(xiàn)，離子液體的毒性大小主要與其陽(yáng)離子有關(guān)，而其陰離子則對(duì)其無(wú)明顯影響；并且同一類型的離子液體其毒性大小與陽(yáng)離子碳鏈大小呈正相關(guān)[10]。此外，有學(xué)者認(rèn)為，離子液體具有脂溶性，可能在動(dòng)物體內(nèi)逐步積累，從而進(jìn)入細(xì)胞，影響細(xì)胞代謝，并產(chǎn)生毒性[11]。

試驗(yàn)采用不同濃度（0.16、0.24、0.36、0.54、0.81 mg/L）的離子液體[C16mim]Cl處理泥鰍胚胎發(fā)育4個(gè)時(shí)期（囊胚期、原腸胚時(shí)期、神經(jīng)胚期、尾芽期）的胚胎，通過(guò)分析各處理中胚胎孵化率和畸形率的變化趨勢(shì)來(lái)評(píng)估離子液體[C16mim]Cl對(duì)受試胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，在較低濃度范圍內(nèi)，離子液體[C16mim]Cl就能夠誘使泥鰍胚胎的孵化率明顯降低，使畸形率快速上升，表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。此外，囊胚期處理后胚胎的畸形率最低，相比其他時(shí)期對(duì)離子液體[C16mim]Cl具有一定的耐受性。分析原因，可能與卵膜的保護(hù)作用有關(guān)，因?yàn)榕咛テ诘穆涯ぞ哂羞x擇透性及對(duì)毒物的天然屏障作用，試驗(yàn)結(jié)果與王君等[4]報(bào)道的蘇丹紅Ⅲ對(duì)泥鰍發(fā)育的毒性研究結(jié)果一致。在神經(jīng)胚期和尾芽期處理后的畸形率又高于囊胚期和原腸胚期，原因可能是神經(jīng)胚期正處于胚胎高度分化期，當(dāng)高度分化胚胎的某部分發(fā)生異常變化后，導(dǎo)致將來(lái)形成的某些組織或器官異常，形成畸形個(gè)體；而尾芽期是許多器官原基形成的時(shí)期，例如體節(jié)和神經(jīng)管等，因此易受外界物質(zhì)影響，而且其距孵出期比較短，其卵細(xì)胞膜的保護(hù)作用有所減弱。同時(shí)，不同時(shí)期胚胎的敏感性存在一定的差異。

此外，試驗(yàn)還測(cè)試了離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍孵出期仔魚(yú)和孵出3 d的仔魚(yú)急性毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)孵出期和孵出3 d的仔魚(yú)敏感性不同，孵出期仔魚(yú)對(duì)離子液體[C16mim]Cl的耐受性要強(qiáng)于孵出3 d的仔魚(yú)。原因可能是早期幼魚(yú)（卵黃吸收期的仔魚(yú)，孵出1～3 d）營(yíng)養(yǎng)供給主要是靠卵黃提供，受外界的影響并不大。由于離子液體[C16mim]Cl的分子結(jié)構(gòu)與陽(yáng)離子表面活性劑的結(jié)構(gòu)相似，所以它能與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)作用，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，或增大細(xì)胞膜的滲透性；隨著仔魚(yú)與毒物充分接觸，其效應(yīng)增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出仔魚(yú)對(duì)離子液體[C16mim]Cl更加敏感[12，13]。

不過(guò)試驗(yàn)只是初步研究了離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍不同胚胎發(fā)育時(shí)期及仔魚(yú)不同發(fā)育階段的毒性作用效應(yīng)，但離子液體[C16mim]Cl對(duì)泥鰍的胚胎及其仔魚(yú)的發(fā)育毒性作用機(jī)制還不明確，有待下一步試驗(yàn)探尋。

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