黃芩苷微生物轉(zhuǎn)化菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

蘇龍++梁廣波++龍文英++張小晴++陳夏露++黃燕燕

摘要：通過羅爾夫青霉（Penicillium rolfsii）發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化，來提升黃芩苷轉(zhuǎn)化率。采用單因素方法對氮源、發(fā)酵接種量、初始pH發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等因素進(jìn)行考查，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化。得到的優(yōu)化發(fā)酵條件是黃芩粉20 g/L，（NH4）2SO4 0.6 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，醋酸鈉0.1 g/L，維生素C 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，pH 5.0，料液比為1∶30，接種量10%，裝液量80 mL/250 mL，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，轉(zhuǎn)速180 r/min。在最優(yōu)條件下，黃芩素含量達(dá)到1.83 mg/mL。

關(guān)鍵詞：黃芩苷；微生物轉(zhuǎn)化；羅爾夫青霉（Penicillium rolfsii）；黃芩素；優(yōu)化

中圖分類號：Q946.83：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1483-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.021

Screening and Identify of the Baicalin Microbial Transformation and Optimization of Fermentation Conditions for Baicalein by Microorganism

SU Long，LIANG Guang-bo，LONG Wen-ying，ZHANG Xiao-qing，CHEN Xia-lu，HUANG Yan-yan

（College of Biology & Pharmacy of Yulin Normal University， Yulin 537000，Guangxi， China）

Abstract： The Penicillium rolfsii fermentation medium and conditions were optimized to increase the baicalin yield. Firstly， using single-factor test， the effects of these 5 parameters， i.e.， nitrogen source， the inoculation amount， initial pH of medium， fermentation time， fermentation temperature on the baicalin yield were studied. Then the key parameters of fermentation conditions were statistically optimized through orthogonal array experiments with 5 factors at 4 levels. The optimal conditions were Scutellaria baicalensis Georgi. power 20 g/L，（NH4）2SO4 0.6 g/L， KH2PO4 0.2 g/L， sodium salt 0.1 g/L， MgSO4 0.1 g/L， vitamin C 0.1 g/L， initial pH 5.0， solid liquid ratio 1∶30， rotation speed 180 r/min， 10% inoculum size in 80 mL working volume（in 250 mL flasks） at 35 ℃ for 6 d. Using these conditions， the baicalein yield was 1.83 mg/mL.

Key words： baicalin； microbial transformation； Penicillium rolfsii； baicalein； optimize

中草藥是自然界賦予華夏的特色藥物，是中華民族歷史文化和現(xiàn)代文明的主要組成部分之一，對國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展具有重要貢獻(xiàn)，是提高漢文化民族健康素質(zhì)的重要保障；并且在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的支柱性作用。中草藥活性成分是中醫(yī)藥用之防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，然而中草藥成分是一個(gè)復(fù)雜的龐大體系，往往很多成分活性低、毒性大、含量低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、合成困難等，如黃芩素在植物中含量非常低，植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）中只有在根部含有少量黃芩素，約含0.49%～2.28%，而其前體物黃芩苷含量約為5.79%～15.31%[1]；現(xiàn)在的天然野生資源隨著中草藥的開發(fā)利用力度持續(xù)加大，儲(chǔ)存量在不斷下降；這樣隨之而來的問題是原料藥來源已經(jīng)無法滿足批量化生產(chǎn)的需求，這也是所有天然創(chuàng)新藥物開發(fā)所面臨的重大難題，是高水平天然藥物能否廣泛應(yīng)用、走向世界的瓶頸。

黃芩素為黃芩苷的水解產(chǎn)物，即黃芩苷元，它是黃芩主要的有效成分之一，來源于黃芩根部?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)屬黃酮類[2]，具有降低腦血管阻力、抗血栓形成和保護(hù)心腦血管、神經(jīng)元的作用[3]，能改善腦部血循環(huán)、增加腦血流量及抗血小板凝集，臨床上多用于腦血管病后癱瘓的治療；還具有抗菌、抗病毒、抑制炎癥反應(yīng)、保肝、利膽、利尿、抗癌[4]、抗氧化、抗過敏、抗病原微生物等功效，能鎮(zhèn)靜、降壓，對治療肝臟疾病等具有良好效果[5，6]。目前獲得黃芩素的方法主要有酸水解法[7]、溶劑提取法[8]、超聲提取法[9]、酶水解法[10，11]和微生物發(fā)酵法[12-15]。試驗(yàn)利用自行篩選的微生物青霉半固態(tài)發(fā)酵法轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素，以期為黃芩苷的有效利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 中藥材黃芩購于玉林市至真藥業(yè)連鎖店，將其打粉，過40目篩，作為發(fā)酵底物備用。標(biāo)準(zhǔn)品黃芩苷、黃芩素（含量99.0%）購于西安市匯林生物公司；其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司。青霉為玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 儀器 主要有Tu21800 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、HH-s數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）、FE20 Five Easy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)和AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①初篩培養(yǎng)基組成：黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品2 g，瓊脂2 g，用去離子水定容到100 mL，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。②復(fù)篩培養(yǎng)基組成：黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品1 g，KH2PO4 0.01 g，醋酸鈉0.005 g，維生素C 0.005 g，MgSO4 0.005 g，pH自然，用去離子水定容到50 mL，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。③發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成：黃芩粉20 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，醋酸鈉0.1 g/L，維生素C 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，pH自然，分裝，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株初篩 配制好初篩培養(yǎng)基平板，從實(shí)驗(yàn)室中草藥轉(zhuǎn)化菌種庫中篩選能轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素的青霉菌株；通過2%的三氯化鐵（用無水乙醇配制）溶液顯色，初步篩選出目的菌株。

1.2.2 菌株復(fù)篩 將初篩的青霉菌株接種至復(fù)篩液體培養(yǎng)基中，于35 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)5 d；取發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，棄上清液取沉淀，向沉淀內(nèi)加入無水乙醇浸泡過夜，第二天80 ℃水浴1 h（每20 min搖晃1次），最后拿出，置于離心機(jī)4 000 r/min離心20 min；取上清液0.1 mL，加入2%三氯化鐵4 mL，再加入無水乙醇0.9 mL，于紫外可見分光光度計(jì)的490 nm處測定[16]。

1.2.3 菌株鑒定 將篩選及純化好的菌株委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司鑒定。

1.2.4 黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 精密稱取120 ℃干燥到恒重的黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得各組成濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別于490 mn處測定各濃度的吸光度，得回歸方程，樣品含量利用回歸方程計(jì)算即得[16]。

1.3 單因素試驗(yàn)

以黃芩素含量為依據(jù)，以黃芩粉為底物，分別考察青霉半固態(tài)發(fā)酵法轉(zhuǎn)化黃芩苷發(fā)酵培養(yǎng)基的不同氮源[蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、黃豆粉、（NH4）2SO4、尿素、不添加（對照）]、不同氮源濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L）、培養(yǎng)基不同初始pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同裝液量（40、60、80、100、120、140 mL/250 mL）、不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、不同發(fā)酵溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）、不同發(fā)酵時(shí)間（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 d）對黃芩素含量的影響。

1.4 L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH、料液比、發(fā)酵時(shí)間、氮源濃度為影響因素，各因素都有4個(gè)水平，進(jìn)行青霉半固態(tài)發(fā)酵法轉(zhuǎn)化黃芩苷L16（45）正交試驗(yàn)，L16（45）正交試驗(yàn)各因素、水平組合見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

經(jīng)過初篩、復(fù)篩和發(fā)酵檢測篩選，得到一株能把黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素的青霉菌株，結(jié)果見圖1。將測定菌株的ITS序列用Blast軟件與GenBank中已報(bào)道的ITS序列進(jìn)行同源性比較后發(fā)現(xiàn)，菌種的ITS序列與在GenBank登記的Penicillium rolfsii（羅爾夫青霉）ITS序列的同源性達(dá)到99%；通過對菌株的菌落形態(tài)及結(jié)合ITS序列同源性比較，可以確定菌種為羅爾夫青霉。

2.2 黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)所獲得的不同黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品濃度溶液的吸光度，做出黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體見圖2。黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=21.108x-0.192 6，R2=1。

2.3 氮源對黃芩素含量的影響

不同氮源對黃芩苷轉(zhuǎn)化的影響見圖3。從圖3可以看出，氮源種類對黃芩苷的轉(zhuǎn)化影響不大，無論是添加有機(jī)氮源還是無機(jī)氮源，對黃芩素含量的影響都差不多；對照中不添加氮源，雖然黃芩素的含量比添加氮源的少，但也能發(fā)生部分轉(zhuǎn)化，可能是由于黃芩藥材來源于植物根部，含有多糖類和蛋白質(zhì)等成分，經(jīng)微生物分解后即產(chǎn)生大量的碳源和氮源，可滿足微生物的生長營養(yǎng)需求。從總體來看，添加氮源比不添加氮源黃芩苷的轉(zhuǎn)化率更高，另外從成本方面考慮，（NH4）2SO4為最佳氮源。

2.4 （NH4）2SO4濃度對黃芩素含量的影響

進(jìn)一步比較（NH4）2SO4對黃芩苷轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可見，隨（NH4）2SO4濃度的增加，其發(fā)酵液中黃芩素含量呈先增加、后減少的變化趨勢，在（NH4）2SO4濃度為0.4 g/L時(shí)，含量達(dá)到最大值。反映出（NH4）2SO4濃度過大后，會(huì)使菌體生長過于旺盛，但不利于代謝產(chǎn)物的積累。因此（NH4）2SO4濃度以0.4 g/L為較合適。

2.5 培養(yǎng)基初始pH對黃芩素含量的影響

培養(yǎng)基不同初始pH對黃芩苷轉(zhuǎn)化的影響見圖5。相對于培養(yǎng)基最適pH而言，過高或者過低的環(huán)境初始pH都會(huì)影響到羅爾夫青霉的生長，進(jìn)而影響羅爾夫青霉的次級代謝產(chǎn)物——β-葡萄糖苷酶的分泌，更影響到酶的催化反應(yīng)。根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道和前期的預(yù)備試驗(yàn)可知，大部分β-葡萄糖苷酶的最適作用環(huán)境是酸性的[17-22]，所以試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基初始pH為酸性。從圖5可見，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在4.0～4.5范圍時(shí)，發(fā)酵液中的黃芩素含量相差不大，而pH低于4.0或高于4.5后，黃芩素的含量相應(yīng)減少，故培養(yǎng)基初始最適pH選擇4.5。

2.6 菌種接入量對黃芩素含量的影響

菌種接入量對黃芩素含量的影響情況見圖6。通常接種量的大小決定了生產(chǎn)菌種在培養(yǎng)中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會(huì)；但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵結(jié)果。過大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，降低生產(chǎn)效率。從圖6可以看出，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中黃芩素的含量逐漸增加，其中接種量為8%和10%時(shí)，黃芩素的含量最高；超過10%后，黃芩苷轉(zhuǎn)化率開始下降?？紤]到羅爾夫青霉生長速度比較慢，選擇10%的接種量為最佳接種量。

2.7 裝液量對黃芩素含量的影響

氧氣是好氧微生物能正常生長繁殖的重要因素之一，溶氧的多少直接影響微生物生長，并影響β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量，進(jìn)而影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化率。不同菌種發(fā)酵、發(fā)酵生產(chǎn)不同的產(chǎn)物對溶氧量要求不盡相同；對于選定的菌種和發(fā)酵生產(chǎn)特定的產(chǎn)物對溶氧的要求，可利用裝液量來探討溶氧的影響。一般是裝液量小的培養(yǎng)基與氧氣的接觸面積大，增加了液體的溶氧量；反之，裝液量大的溶氧量較少。試驗(yàn)里裝液量對黃芩素含量的影響見圖7。由圖7可見，當(dāng)裝液量為80 mL/250 mL（三角瓶）時(shí)，黃芩素的含量最高；裝液量過多或過少，黃芩素的含量都減少。另外，裝液量與轉(zhuǎn)化環(huán)境的溶氧量有直接的關(guān)系，增大溶氧量有利于細(xì)胞生長、產(chǎn)酶，進(jìn)而促進(jìn)黃芩素的產(chǎn)生；裝液量太少，將導(dǎo)致細(xì)胞生長過快，營養(yǎng)物質(zhì)消耗加速，反而會(huì)影響β-葡萄糖苷酶的分泌，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。因此，在轉(zhuǎn)化黃芩苷時(shí)，培養(yǎng)基的裝液量以80 mL/250 mL（三角瓶）為宜。

2.8 料液比對黃芩素含量的影響

由于發(fā)酵底物是黃芩打粉過40目篩后直接添加到培養(yǎng)基中，所以屬于半固態(tài)發(fā)酵，因此培養(yǎng)基含水量是一個(gè)很重要的影響因素；包被在固態(tài)基質(zhì)表面的水膜能溶解微生物需要的無機(jī)鹽和代謝產(chǎn)物，同時(shí)為微生物的生長提供了所需的潮濕環(huán)境。另外，基質(zhì)含水量也影響著培養(yǎng)系統(tǒng)中的氧氣供應(yīng)、氣體流動(dòng)等微環(huán)境，也是發(fā)酵成敗的制約條件，所以，料液比對半固態(tài)發(fā)酵有著重要的影響。試驗(yàn)里料液比對黃芩素含量的影響情況見圖8。由圖8可知，隨著料液比的增加，發(fā)酵液中黃芩素的含量也相應(yīng)增加，但當(dāng)料液比>1∶35以后，黃芩苷的轉(zhuǎn)化率開始下降。在低料液比（1∶15）時(shí)，隨著發(fā)酵的進(jìn)程，由于水分的蒸發(fā)，底物粘性提高，導(dǎo)致底物結(jié)塊現(xiàn)象嚴(yán)重，通透性降低，溶氧傳遞與吸收也降低，限制了菌株的生長代謝，最后直接影響菌體的生長，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降；料液比高時(shí)，底物流質(zhì)狀態(tài)不理想，溶氧少及傳遞效果差，菌體代謝得不到充分發(fā)揮，造成資源浪費(fèi)；所以料液比選擇1∶30較為適宜。

2.9 發(fā)酵溫度對黃芩素含量的影響

溫度是影響微生物生長和存活的主要環(huán)境因素之一，對發(fā)酵的影響很大，溫度的高低影響酶的反應(yīng)、氧的溶解和傳遞速率、菌體生長及產(chǎn)物合成等方面。試驗(yàn)里發(fā)酵溫度對黃芩素含量的影響情況見圖9。由圖9可知，35 ℃發(fā)酵時(shí)黃芩素的含量最高。20 ℃發(fā)酵時(shí)黃芩素的含量最少，說明20 ℃使羅爾夫青霉生長緩慢，還沒有β-葡萄糖苷酶的分泌或者分泌的酶量比較少，造成黃芩素的含量比較少。而溫度過高，雖然菌種生產(chǎn)速度加快，但也有可能營養(yǎng)成分消耗過快，β-葡萄糖苷酶的分泌量也會(huì)減少，導(dǎo)致黃芩素的含量下降；另外，也可能溫度過高不適合β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

2.10 發(fā)酵時(shí)間對黃芩素含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對黃芩素含量的影響情況見圖10。由圖10可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，黃芩素的含量逐漸增加，在接種發(fā)酵第六天時(shí)，黃芩素的含量達(dá)到最大；繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間，黃芩素的含量則有下降的趨勢。發(fā)酵時(shí)間不僅影響微生物的生長速率和生長量，還會(huì)影響微生物的代謝強(qiáng)度和代謝物的多寡；β-葡萄糖苷酶屬于羅爾夫青霉的次級代謝產(chǎn)物，一般是微生物生長到中后期才開始分泌；發(fā)酵時(shí)間的延長使得菌體的代謝產(chǎn)物β-葡萄糖苷酶的量增大，從而提高了黃芩苷的轉(zhuǎn)化率，故發(fā)酵時(shí)間選擇6 d。

2.11 發(fā)酵條件L16（45）正交試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置的羅爾夫青霉半固態(tài)發(fā)酵法轉(zhuǎn)化黃芩苷L16（45）正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2。從表2可見，通過對L16（45）正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，可知對黃芩苷轉(zhuǎn)化影響因素的高低排序?yàn)镈、A、B、E、C，即料液比、（NH4）2SO4濃度和培養(yǎng)基初始pH對黃芩苷轉(zhuǎn)化的影響較大，發(fā)酵時(shí)間對黃芩苷轉(zhuǎn)化的影響較小，發(fā)酵溫度對黃芩苷轉(zhuǎn)化的影響最小。最佳的組合為A4B4C2D2E3，即發(fā)酵溫度35 ℃、培養(yǎng)基初始pH 5.0、（NH4）2SO4濃度0.6 g/L、料液比為1∶30、發(fā)酵時(shí)間為6 d。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)檢測，在上述最優(yōu)條件下，黃芩素含量最高，達(dá)1.83 mg/mL。

3 小結(jié)

通過單因素和L16（45）正交試驗(yàn)，對羅爾夫青霉發(fā)酵黃芩粉轉(zhuǎn)化黃芩素的條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果最優(yōu)的發(fā)酵條件為黃芩粉20 g/L、（NH4）2SO4濃度0.6 g/L、KH2PO4濃度0.2 g/L、醋酸鈉濃度0.1 g/L、維生素C濃度0.1 g/L、MgSO4濃度0.1 g/L、發(fā)酵溫度35 ℃、培養(yǎng)基初始pH 5.0、料液比為1∶30、接種量10%、裝液量80 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間為6 d。在此最優(yōu)條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的黃芩素含量達(dá)到1.83 mg/mL。

中草藥活性成分是中草藥防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是中草藥現(xiàn)代化研究的重要內(nèi)容之一。微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中草藥活性成分的現(xiàn)代化研究中具有十分重要的作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中草藥活性成分的合成、結(jié)構(gòu)修飾以及新化合物的開發(fā)中。微生物轉(zhuǎn)化可以有效地提高已知中草藥活性成分的藥效，降低毒副作用，改善水溶性和生物利用度，還可以用來生產(chǎn)具有重要應(yīng)用價(jià)值的微量天然活性先導(dǎo)化合物，同時(shí)可用于藥物代謝機(jī)制的研究。試驗(yàn)通過對羅爾夫青霉半固態(tài)發(fā)酵法轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素的條件進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果對中草藥生物活性的轉(zhuǎn)化具有一定的參考價(jià)值。該方法條件溫和、易于控制，轉(zhuǎn)化率高，可極大地提高中草藥黃芩的利用率。

致謝：試驗(yàn)得到了廣西壯族自治區(qū)農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育基地）、廣西生物化工、農(nóng)產(chǎn)品深加工與安全技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)的幫助，謹(jǐn)此致謝。

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