富硒酵母的篩選鑒定及其作為魚飼料的應用研究

凡敏++黃珍++李欣++王志++陳雄++代俊

摘要：將泡菜汁樣品稀釋后涂布到含1 g/L Na2SeO3的YEPD培養(yǎng)基上，篩選出一株耐硒菌株FXY-4，用不同Na2SeO3濃度的YEPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Na2SeO3的濃度為0.5 g/L時菌株富硒能力最強，為0.54 mg/g（干重）。運用分子生物學和生理生化方法鑒定FXY-4為光滑假絲酵母（Candida glabrata）。將FXY-4添加在魚飼料中喂食錦鯉，探究其對錦鯉的生長與血清酶學指標的影響，結果顯示添加菌株FXY-4能提高錦鯉生長、免疫學指標和魚肉中有機硒的含量。

關鍵詞：硒；光滑假絲酵母（Candida glabrata）；鑒定；魚飼料

中圖分類號：S816.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1416-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.004

Isolation，Identification and Application Research of Fish Feed of Selenium-rich Yeast

FAN Min， HUANG Zhen， LI Xin， WANG Zhi， CHEN Xiong， DAI Jun

（Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation/Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education/College of Bioengineering and Food，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract： A selenium-rich strain FXY-4 in pickle juice was screened from YEPD medium containing 1 g/L Na2SeO3. The concentration of Na2SeO3 of strain FXY-4 was 0.54 mg/g（dry weight） in YEPD culture of 0.5 g/L selenium. Using molecular biology and physiological and biochemical methods，F(xiàn)XY-4 was identified as Candida glabrata. Fish feed containing strain FXY-4 was fed to koi. It showed that feed could increase the growth， immunological parameters and organic selenium content of koi.

Key words： selenium； Candida glabrata； identity； fish feed

隨著生物醫(yī)學技術的發(fā)展，硒（Se）對人體的重要性已逐漸被證實并引起了人們的高度重視。作為人體必需的14種微量元素之一，硒具有抗癌、解毒、保肝和提高人體免疫力等重要生理功能，缺硒會引起人體重要器官功能的失調(diào)并最終導致多種疾病的發(fā)生[1]。硒也是動物體必需的微量元素，在對動物機體抗應激、促進生長、提高免疫力等方面發(fā)揮著重要作用[2]。魚類飼料中硒的營養(yǎng)學研究表明，飼料中過高或過低的硒含量均會影響魚類健康，因此硒在動物飼料中最適添加量的研究得到了廣泛開展。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，一些致病菌能迅速繁殖，進而引發(fā)相應的疾病[3]。目前，主要是通過在飼料中添加抗生素的方法來控制解決。然而，抗生素在飼料中的大量使用存在著嚴重的弊端，如引起內(nèi)源性感染和二重感染、耐藥菌株的產(chǎn)生、免疫力下降和水產(chǎn)品及環(huán)境中殘留等[4]。相比之下，酵母具有安全、無污染、免疫增強等優(yōu)點，成為抗生素替代品[5]。篩選得到富硒能力強的酵母，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重要的現(xiàn)實意義。目前，關于高產(chǎn)富硒光滑假絲酵母（Candida glabrata）在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中的應用鮮見報道。

本研究從泡菜中培養(yǎng)得到一系列酵母菌單菌落，通過亞硒酸抗性篩選，得到具有增強免疫和抗應激功能的富硒能力強的酵母菌株。對該菌株進行鑒定，并研究在飼料中添加該菌株后對錦鯉體重、血清酶指標等的影響，以期為強化動物飼料的營養(yǎng)價值、減少抗生素在飼料中的添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

泡菜為湖北農(nóng)家自制。

主要試劑有酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、鹽酸、葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、環(huán)己烷、氨水、硫酸、磷酸、瓊脂粉、亞硒酸鈉、濃硝酸、溶菌酶（Lysozyme）、蛋白酶K（Protease K）、RNase A、氯仿、異戊醇、水飽和酚、磷酸緩沖液（PBS）EX-Taq DNA聚合酶，購自上海申試化工工貿(mào)公司或?qū)毶锕こ蹋ù筮B）有限公司。

主要儀器有生物安全柜，Esco公司；恒溫水浴鍋（雙哈SSY-H型）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F160型）、全自動控制臥式電熱蒸汽消毒器（雙哈YX600W型），東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9160BS-III型），新苗醫(yī)療器械制造公司；瓊脂糖凝膠電泳儀（Mupid-2plus），Advance（日本）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（DRC-100H/DIX-254A型），Gene公司（美國）。

1.2 菌種的篩選

YEPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母粉1%、pH 7.0；加2%瓊脂即成固體培養(yǎng)基。

稱取1.0 mL泡菜汁加入盛有9 mL無菌水的試管中，在渦旋器上充分振蕩10 min，然后靜置5 min，采用10倍梯度稀釋法將上清液制成10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液分別涂布到含1 g/L的Na2SeO3 YEPD平板上，倒置，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長狀態(tài)、菌落大小和菌落形態(tài)，并挑取單菌落，將其命名為FXY-4，轉(zhuǎn)接到YEPD斜面上保存。

1.3 菌株富硒能力測定

將Na2SeO3溶液過濾除菌后加入到YEPD培養(yǎng)基中，配成終濃度分別為0.1、0.5、1.0 g/L的Na2SeO3的培養(yǎng)液。接種后30 ℃培養(yǎng)24 h，先用紫外分光光度計測定OD600 nm，再采用國家標準（GB 5009.93-2010）原子熒光光度計法測定硒元素含量。用未加Na2SeO3的YEPD培養(yǎng)基作為對照。

選取培養(yǎng)18～24 h的FXY-4菌體，用滅菌棉簽刮下3 mm左右的待測菌落2～3個，置于裝有3 mL 0.45%生理鹽水的試管中進行稀釋，用標準比濁計測菌液濃度（約0.5個麥氏單位），用菌液填充卡片，置于讀數(shù)器進行自動讀卡。

1.4 酵母基因組提取

染色體DNA的提取步驟[6]如下，①取1.5 mL菌液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心5 min；②棄上清，900 μL磷酸緩沖液（PBS）重懸沉淀，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min；③棄上清，加入300 μL TE和200 μL 10 mg/mL溶菌酶，混勻，37 ℃溫育1 h，每隔15 min顛倒混勻一次；④向沉淀加入600 μL TENS裂解液（200 mmol/L NaCl，100 mmol/L Tril-HCl pH 8.0， 2.0% SDS，50 mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100）和20 mg/mL蛋白酶K 10 μL，混勻，55 ℃溫育1 h，每隔15 min顛倒混勻一次；⑤4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清；⑥向上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）充分混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；⑦重復步驟6；⑧將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，2倍體積的無水乙醇，混勻，-20 ℃放置60 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；⑨棄上清，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體后風干，加入30 μL無菌水和10 mg/mL RNase A 0.5 μL，-20 ℃保存。

1.5 26S rRNA基因擴增和測序

根據(jù)Kurtzman等[7]的方法，引物為NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′），PCR擴增體系：Premix Taq酶25 μL，上游引物20 μmol/L 1 μL， 下游引物20 μmol/L 1 μL，模板DNA 200 ng/μL 1 μL，無菌水22 μL，總體積50 μL。PCR擴增條件：預變性，94 ℃，10 min；變性，94 ℃，30 s；退火，60 ℃，1 min；延伸，72 ℃，1 min，30個循環(huán)；再延伸，72 ℃，10 min。

1.6 26S rRNA基因序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序后的26S rRNA基因序列通過BLAST[8]比對程序進行同源性分析。利用Clustalx1.8、 MEGA 5.0軟件，根據(jù)26S rRNA基因序列相似度分析的結果，選取相關模式菌株的26S rRNA基因序列，采用Neigbor-joining（鄰位相接法，NJ）算法得到相應的系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.7 富硒光滑假絲酵母FXY-4作為魚飼料添加劑的應用

采用400條體重相近、健康的錦鯉（約1.80 g/條），隨機分成4個處理組，每個處理4個重復，每個重復25條。處理1為對照（CK），商業(yè)飼料，不含任何藥物添加劑；處理2為抗生素飼料，在商業(yè)飼料中添加一定量抗生素；處理3為低量添加富硒光滑假絲酵母FXY-4飼料，在商業(yè)飼料中補給富硒光滑假絲酵母FXY-4（飼料中終濃度為5×108 CFU/kg）；處理4為高量添加富硒光滑假絲酵母FXY-4飼料，在商業(yè)飼料中補給富硒光滑假絲酵母FXY-4（飼料中終濃度為5×1010 CFU/kg），每天投食量按照體重的3%投食2次，喂食30 d后，測定錦鯉體重與血清中過氧化氫酶（CAT）及超氧化物歧化酶（SOD）活性[10]。

1.8 喂食富硒酵母FXY-4飼料對魚肉中硒含量的測定

隨機挑取喂食高量添加富硒酵母FXY-4飼料的錦鯉50條，解剖后混勻魚肉，稱取2.0 g（精確至0.1 mg），放入100 mL燒杯中，加10 mL HNO3浸泡過夜，再加入2 mL HClO4，同時用無富硒酵母FXY-4飼料作為空白對照，搖勻，于電熱板上低溫加熱硝化至白煙冒盡，如果硝解液為黑色或醬褐色，則補加HNO3繼續(xù)硝化至黑色或醬褐色消失且溶液呈淡黃色，剩余約1 mL溶液時，加入5 mL 6 moI/L HCl，加熱微沸5～10 min，冷卻，洗入25 mL容量瓶中，用6 mol/L HCl稀釋至刻度。采用國家標準方法（GB 5009.93-2010）—原子熒光光度計法測定硒元素含量。

2 結果與分析

2.1 富硒酵母的分離純化

在1 g/L的Na2SeO3 YEPD平板上培養(yǎng)3 d，挑取出一株直徑1～2 mm、圓形、乳白色、表面蠟狀光澤的FXY-4單菌落。通過顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其細胞大小為（3～4） μm×（6～7） μm，橢球形，初步判定為酵母菌屬。菌體在0.1、0.5、1.0 g/L Na2SeO3的YEPD培養(yǎng)液中30 ℃培養(yǎng)24 h后，OD600 nm分別為15.4、5.3、2.1，運用國標熒光法檢測富硒含量分別為0.39、0.54、0.51 mg/g（DW）。綜合菌體在不同Na2SeO3濃度下的生長狀況和富硒能力，后續(xù)制作飼料時選擇0.5 g/L Na2SeO3的培養(yǎng)濃度。

2.2 Bio Mérieux VITEK 2鑒定

分別運用Bio Mérieux VITEK 2自動鑒定分析儀和26S rRNA基因測序技術對FXY-4進行生理生化特性鑒定（表1）。由表1可知，F(xiàn)XY-4與光滑假絲酵母具有相同特征的生理生化反應[11]。

2.3 26S rRNA基因序列分析

2.3.1 菌株FXY-4 26S rRNA基因序列 測序結果顯示，菌株FXY-4的26S rRNA基因約570 bp。

2.3.2 菌株FXY-4 26S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹 將測序后的26S rRNA基因序列通過BLAST比對程序進行同源性分析，F(xiàn)XY-4 26S rRNA基因與Candida glabrata種幾十種菌株的相似度為100%。挑選17株有代表性的C. glabrata菌株26S rRNA基因與FXY-4一起構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。由圖1可知，F(xiàn)XY-4與C. glabrata Y7_300（LC015357）、 C. glabrata HC07C（KJ624031）、C. glabrata HC10C （KJ624031）、C. glabrata T119-NL1（KF214423）、 C. glabrata ATCC 90030（KU729149）、C. glabrata ATCC 66032（KU729145）、C. glabrata ATCC MYA-2950（KU729136）、C. glabrata Y7_298（LC015355）、C. glabrata T118-NL1（KF214422）、C. glabrata CG1107（KM055440）、C. glabrata LMICRO529（KF746392）聚類在一個分支上且進化距離相同。由此可見，該菌株屬C. glabrata，將其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2015664。

2.4 喂食富硒酵母FXY-4飼料對錦鯉體重與血清酶指標的影響

由表2、表3可知，喂養(yǎng)30 d后，低量添加富硒酵母飼料錦鯉體重比對照組提高17.8%，比抗生素組提高16.1%；高量添加富硒酵母飼料錦鯉比對照組提高19.9%，比抗生素組提高18.1%。在血清CAT活性上，低量添加富硒酵母飼料錦鯉體重比對照組提高62.5%，比抗生素組提高45.7%；高量添加富硒酵母飼料錦鯉比對照組提高127.1%，比抗生素組提高103.6%。在血清SOD活性上，低量添加富硒酵母飼料錦鯉比對照組提高31.7%，比抗生素組提高26.2%；高量添加富硒酵母飼料錦鯉比對照組提高34.5%，比抗生素組提高28.8%。

2.5 喂食富硒酵母FXY-4飼料對魚肉中硒含量的影響

采用國家標準（GB 5009.93-2010）—原子熒光光度計法測定硒元素含量，測得高量添加富硒酵母飼料喂養(yǎng)的錦鯉魚肉中硒含量為2.23 mg/kg，大于富硒食品硒含量0.20 mg/kg的標準。

3 小結與討論

本研究從泡菜汁中分離了一株富硒酵母FXY-4菌株，利用分子生物學和生理生化方法鑒定其為光滑假絲酵母。菌體在0.5 g/L Na2SeO3的YEPD培養(yǎng)液中30 ℃培養(yǎng)24 h后，OD600 nm為5.3，菌體硒含量為0.54 mg/g（DW），在含硒培養(yǎng)基中生長快速且富硒能力強。將富硒菌株添加到飼料中喂食錦鯉，與對照組相比體重與血清酶指標均有明顯提高。結果表明，該菌株具有較強的富硒能力，在魚飼料中添加富硒光滑假絲酵母，可以增加魚飼料中的有機硒，降低抗生素在飼料中的添加量，充分發(fā)揮富硒酵母增強免疫和促進生長的活性，強化動物飼料的營養(yǎng)價值，具有良好的市場前景。

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