色譜及其聯(lián)用技術(shù)在硒形態(tài)分析中的應(yīng)用

廖美林++馬作江

摘要：硒是人體必需的微量元素，食品中的硒元素形態(tài)有多種，硒的化學(xué)形態(tài)可以影響人體補(bǔ)硒效果，硒形態(tài)分析研究具有重要意義。硒形態(tài)分析比傳統(tǒng)的硒總量分析復(fù)雜很多，本研究綜述了色譜及其聯(lián)用技術(shù)在硒形態(tài)分析中的應(yīng)用，主要包括液相色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳、離子色譜等光譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以期為硒形態(tài)的分析提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：硒；形態(tài)；色譜；聯(lián)用技術(shù)

中圖分類號(hào)：O657.7；O613.52 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）08-1413-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.003

Application of Chromatography and Related Hyphenated

Techniques of Selenium Speciation Analysis

LIAO Mei-lin， MA Zuo-jiang

（National Quality Supervision and Testing Center for Selenium Rich Products/Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture Center for Food and Drug Control， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： Selenium is the essential trace elements for human body. There are many forms of selenium in food， and the effect of selenium supplement is determined by the selenium speciation， the research of speciation analysis of selenium is significance，Selenium speciation analysis is much more complex than the total content determination， the application of chromatography and related hyphenated techniques of selenium speciation analysis is reviewed， including liquid chromatography，gas chromatography，Ion Chromatography，capillary electrophoresis and related hyphenated with spectrometry/mass spectrometry. In order to provide a theoretical basis for the analysis of selenium speciation.

Key words： selenium； speciation； chromatography； hyphenated techniques

硒是人體必需的微量元素之一，硒的不同化學(xué)形態(tài)對(duì)人體的吸收、生物效應(yīng)、毒性及防癌作用不同。許多日常食品中硒的可利用價(jià)值由硒的化學(xué)形態(tài)決定，硒形態(tài)主要分為無機(jī)硒和有機(jī)硒2種，無機(jī)硒的毒性大，而有機(jī)硒的毒性小。無機(jī)硒形態(tài)主要有HSe-、H2Se、金屬硒化物、硒酸鹽、亞硒酸鹽等，有機(jī)硒的形態(tài)主要包括甲基硒、二甲基硒、二甲基二硒等硒醚，硒代氨基酸，硒蛋白，硒多糖，硒核酸等，其中硒代氨基酸和硒蛋白是生物體內(nèi)最主要的有機(jī)硒存在形態(tài)。由于硒形態(tài)復(fù)雜，硒形態(tài)分析比傳統(tǒng)的硒總量分析復(fù)雜很多。色譜分離及光譜/質(zhì)譜檢測技術(shù)的發(fā)展，以及各種連接技術(shù)的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，為硒的形態(tài)分析提供了技術(shù)支持。目前硒形態(tài)研究主要以硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代氨基酸等小分子硒化合物為主。分析方法主要是利用液相色譜、氣相色譜、離子色譜、毛細(xì)管電泳及其聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)各種含硒化合物的不同性質(zhì)，采用不同的色譜及其聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析。

1 硒形態(tài)的色譜聯(lián)用檢測技術(shù)

1.1 液相色譜及其聯(lián)用法

液相色譜（HPLC）法是目前應(yīng)用最廣的色譜分離方法，與光譜或質(zhì)譜技術(shù)等聯(lián)用可分離無機(jī)態(tài)物質(zhì)、小分子代謝物、硒代氨基酸、含硒蛋白等多種物質(zhì)，是目前硒形態(tài)分析的主流方法。主要有液相色譜法（HPLC）、液相色譜與原子熒光聯(lián)用法（HPLC-AFS）、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-ICP-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS）等。

1.1.1 液相色譜法 HPLC法在硒形態(tài)分析中，主要是對(duì)不同樣品的預(yù)處理方法、使用的衍生試劑、流動(dòng)相和色譜條件等進(jìn)行研究。潘紅陽等[1]優(yōu)化了樣品預(yù)處理方法，并建立了柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測富硒脫水菜心中硒代胱氨酸（SeCys）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMe-Cys）和硒代蛋氨酸（SeMet）的方法。劉建群等[2]采用柱前衍生-高效液相熒光法對(duì)硒營養(yǎng)強(qiáng)化奶粉中L-硒-甲基硒代半胱氨酸含量進(jìn)行了檢測。李紅衛(wèi)等[3]采用6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解富硒米曲霉48 h，提取樣品中的有機(jī)硒，4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，再利用高效液相色譜法對(duì)其有機(jī)硒形態(tài)進(jìn)行了分析。

1.1.2 液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法 原子熒光光譜（AFS）法在國內(nèi)發(fā)展很快，是總硒含量測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。但對(duì)于硒形態(tài)分析研究，多需要與色譜聯(lián)用，現(xiàn)在主要是與液相色譜聯(lián)用，國內(nèi)已經(jīng)有多款液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀器（形態(tài)分析儀），是由液相色譜與氫化物原子熒光聯(lián)用（HPLC-HG-AFS）的元素形態(tài)分析技術(shù)。能有效對(duì)硒、砷、汞等元素形態(tài)進(jìn)行分離和檢測，該技術(shù)的優(yōu)勢在于具備了液相分離的優(yōu)點(diǎn)，能利用AFS的高靈敏度和元素特異性，儀器的整體價(jià)格也不高。肖志明等[4]建立了富硒酵母中Se（IV）、Se（VI）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）4種硒形態(tài)的高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜分析方法。尚德榮等[5]采用HPLC-HG-AFS法對(duì)水產(chǎn)品中硒的賦存形態(tài)檢測進(jìn)行研究。韋昌金等[6]利用離子交換液相色譜-氫化物發(fā)生雙道原子熒光聯(lián)用法，同時(shí)測定了富硒營養(yǎng)品中的4種砷形態(tài)和3種硒形態(tài)。謝小雪等[7]建立了離子交換液相色譜-原子熒光聯(lián)用法同時(shí)測定水產(chǎn)品中硒代胱氨酸SeCys、硒代蛋氨酸SeMet和Se（VI）等3種硒形態(tài)的方法。HPLC-AFS法具有硒形態(tài)分離效果好、光譜干擾少、靈敏度高等特點(diǎn)，符合一般實(shí)驗(yàn)室的檢測要求。

1.1.3 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法

電感偶合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）具有較寬的動(dòng)態(tài)線性范圍，可以高效使待測樣原子化，能同時(shí)進(jìn)行幾十個(gè)元素的定量測定，譜線簡單，干擾相對(duì)于光譜技術(shù)要少，既可用于元素分析，還可進(jìn)行同位素組成的快速測定。這些特點(diǎn)使得它在元素形態(tài)分析中具有重要意義，由于液相色譜的流速和ICP-MS進(jìn)樣速度一致，其聯(lián)用接口非常簡單。液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ICP-MS）法是目前研究報(bào)道最多的元素形態(tài)分析方法。結(jié)合液相色譜的特點(diǎn)，具有進(jìn)樣量小、分析速度快、分離效果好、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。在各類食品中硒、砷、錫、汞等元素形態(tài)分析領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用。王丙濤等[8]建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測食品中5種硒形態(tài)的方法。王欣等[9]建立了富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亞硒酸根（SeO32-）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）、硒脲（SeUr）、硒代乙硫氨酸（SeEt）等6種硒形態(tài)的高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。Kapolna等[10]采用體積排阻色譜（SEC-HPLC）及離子對(duì)色譜（IP-RP-HPLC）與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)富硒韭菜的硒形態(tài)進(jìn)行了研究分析。

1.1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法主要包括液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法（LC-MS-MS）、液相色譜-飛行質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-TOF-MS），使該法具有靈敏度高、檢出限低、專一性強(qiáng)、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，能有效排除樣品中大量基質(zhì)的干擾，且能分析出硒同位素豐度光譜圖及其分子量信息，進(jìn)行含硒化合物準(zhǔn)確定性及定量分析。張明等[11]應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS-MS）對(duì)富硒植物中的γ-谷氨酰胺-硒甲基-硒半胱氨酸（GSeMC）、硒甲基-硒半胱氨酸（SeMC）、硒胱氨酸（SeCys）和硒蛋氨酸（SeMet）等4種有機(jī)含硒化合物進(jìn)行了快速篩查分析。鐵梅等[12]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)富硒大豆可溶性蛋白中的硒代蛋氨酸進(jìn)行了定性定量分析。肖強(qiáng)等[13]采用超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-TOF-MS）方法同時(shí)測定了硒蛋氨酸（SeMet）和硒胱氨酸（SeCys）含量。

1.2 氣相色譜及其聯(lián)用法

氣相色譜（GC）具有分辨率高、分析速度快、儀器設(shè)備消耗低等優(yōu)點(diǎn)?？梢灾苯臃蛛x檢測易揮發(fā)的甲基硒、二甲基硒等硒形態(tài)化合物，而無機(jī)的硒酸鹽、亞硒酸鹽以及硒代氨基酸等難揮發(fā)的硒化合物，必須通過氫化物發(fā)生、酯化和氨基的?；蛲榛仍噭┓磻?yīng)得到沸點(diǎn)較低的衍生產(chǎn)物才能用氣相色譜法實(shí)現(xiàn)分離檢測，且衍生化步驟使分離/分析過程復(fù)雜化，增加了待測硒形態(tài)丟失的可能性。陳曉霞等[14]通過異丙醇、七氟丁酸酐等試劑將對(duì)富硒丹參中的硒蛋氨酸衍生化反應(yīng)后， 采用GC法進(jìn)行了分析測定。氣相色譜分離多采用聯(lián)用技術(shù)對(duì)硒形態(tài)進(jìn)行定性定量分析。Lee等[15]分別用GC法和GC-MS法使硒代氨基酸與其他氨基酸得到有效分離，并對(duì)西蘭花中的硒代氨基酸含量進(jìn)行了分析。張浩等[16]采用氯甲酸乙酯衍生法，研究了硒氨基酸衍生物的一級(jí)質(zhì)譜以及二級(jí)碰撞離子裂解規(guī)律，建立了硒蛋氨酸的GC-MS/MS測定方法，且對(duì)毛豆中的硒蛋氨酸含量進(jìn)行了測定。段建坤[17]采用頂空吸附萃取-GC-ICP-MS法測定了洋蔥的揮發(fā)性有機(jī)硒化合物。

1.3 毛細(xì)管電泳及其聯(lián)用法

毛細(xì)管電泳（CE）以電滲流為驅(qū)動(dòng)力、毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)目標(biāo)分子所帶電荷數(shù)與分子本身大小的比值進(jìn)行分離，具有高分辨率、低檢測限等特點(diǎn)。王柏松等[18]以十二烷基三甲基溴化銨（CTAB）為電流改性劑對(duì)砷酸根和硒酸根進(jìn)行了毛細(xì)管電泳分離。李平靜等[19]利用動(dòng)態(tài)pH界面堆積毛細(xì)管電泳法對(duì)硒代氨基酸進(jìn)行了分析。馮金榮等[20]設(shè)計(jì)了一種毛細(xì)管電泳氫化物發(fā)生裝置，利用該裝置將（CE）分離后的2種硒形態(tài)轉(zhuǎn)化為氫化物，通過CE-ICP-AES聯(lián)用對(duì)其檢測分析。Zhao[21]采用CE-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)Se（IV）、Se（VI）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）等硒形態(tài)進(jìn)行了分析檢測。毛細(xì)管電泳（CE）分離效率高，操作條件溫和，但是在分離過程中，樣品中硒形態(tài)可能由于電解質(zhì)或pH的調(diào)節(jié)而發(fā)生變化，樣品的組成也是影響CE分離的一個(gè)重要因素，并且CE與ICP-MS的接口技術(shù)還不成熟。

1.4 離子色譜及其聯(lián)用法

離子色譜法（IC）作為一種有效的分離和檢測技術(shù)，已經(jīng)在金屬和非金屬離子的測定中得到了較多應(yīng)用，已成為解決復(fù)雜機(jī)體中超痕量硒形態(tài)分析的有效工具。秦冰等[22]采用離子色譜-積分脈沖安培檢測法（HPAEC-IPAD）對(duì)茶樹葉中硒代氨基酸進(jìn)行定性和定量分析。林立等[23]采用離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（IC-ICP-MS）測定了奶粉中的硒酸鹽[Se（VI）]、亞硒酸鹽[Se（IV）]、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代胱氨酸（SeCys）等4種硒形態(tài)。

2 硒形態(tài)的色譜聯(lián)用鑒定技術(shù)

硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只有很少的幾種，加之硒在生物體內(nèi)吸收和代謝過程的復(fù)雜性和多樣性，很難實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中各種含硒未知形態(tài)的分析，所以需要多種聯(lián)用技術(shù)對(duì)其分子結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行鑒定分析。王真真等[24]采用HPLC-MS/MS法，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對(duì)以及HPLC-ICP/MS法，對(duì)富硒玉米蛋白的酶水解物中硒肽及含硒氨基酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。結(jié)果確定了4種含硒氨基酸及5個(gè)硒小肽。劉瓊等[25]對(duì)微量含硒蛋白檢測技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行了綜述，通過凝膠電泳與-電感耦合等離子體質(zhì)譜（LA-ICP-MS）檢測含硒蛋白，用胰酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解后，既可用毛細(xì)管高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（Cap-HPLC-ICP-MS）或納升級(jí)高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（Nano-HPLC-ICP-MS）檢測含硒多肽，也可用基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行含硒蛋白的多肽質(zhì)量指紋鑒定（PMF）和納升級(jí)高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（Nano-HPLC-ESI-MS/MS）進(jìn)行蛋白質(zhì)識(shí)別和多肽序列測定。

3 小結(jié)

目前多種色譜聯(lián)用技術(shù)是硒形態(tài)分析的主流，HPLC與ICP-MS、AFS等的聯(lián)用是硒形態(tài)分析的主要方法，未知硒形態(tài)的結(jié)構(gòu)鑒定中應(yīng)用較多的是HPLC-MS-MS/TOF-MS等。硒形態(tài)分析難度較大，且有機(jī)硒具有多種形態(tài)，有些已經(jīng)確認(rèn)種類，但是也有一部分由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)而無法確認(rèn)，硒的形態(tài)分析方法的實(shí)用化和標(biāo)準(zhǔn)化是目前硒形態(tài)分析的瓶頸，這方面還要做大量的研究工作。

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