基因功能缺失技術(shù)及研究現(xiàn)狀

寧慧宇++劉才++鄒華文

摘要：基因功能缺失是目前研究基因功能最重要、最有效的手段之一。目前應(yīng)用比較廣泛的基因功能缺失技術(shù)主要有反義RNA技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)、CRISPR-Cas系統(tǒng)等。這些技術(shù)通過抑制或者沉默特定基因的表達(dá)，研究生物體相關(guān)表型變化，推測該基因的相關(guān)功能。在實(shí)際研究中，基因功能缺失往往和基因過量表達(dá)一起，為基因的功能研究提供最直接的證據(jù)，在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本研究系統(tǒng)介紹了幾種常用的基因功能缺失技術(shù)的發(fā)展歷程、技術(shù)原理及應(yīng)用等，并展望未來的研究和應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：反義RNA；RNA干擾；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系統(tǒng)

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1405-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.002

Research Progress on Loss of Gene Function Technologies

NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b

（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.

Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases

20世紀(jì)50年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著人們對生命科學(xué)的研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時代。隨著后基因組時代的到來，基因組學(xué)的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息結(jié)構(gòu)、組成等轉(zhuǎn)移到對功能的研究上。除了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因（基因過量表達(dá)）外，定向抑制或完全消除特定基因的表達(dá)也是目前研究基因生物學(xué)功能的重要手段。因此，出現(xiàn)了反義RNA、RNA干擾等技術(shù)。隨著研究技術(shù)手段的發(fā)展，近年來又興起了ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)、CRISPR-Cas系統(tǒng)等基因功能修飾技術(shù)。這些技術(shù)不斷被發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，極大地促進(jìn)了生物學(xué)研究的發(fā)展。本研究主要對基因功能缺失技術(shù)發(fā)展歷程、技術(shù)原理及應(yīng)用等方面進(jìn)行概述。

1 反義RNA技術(shù)

反義RNA是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補(bǔ)序列的RNA分子，它通過與靶RNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的結(jié)合方式影響mRNA的后續(xù)翻譯過程。反義RNA最早在原核生物E.coli的產(chǎn)腸桿菌素的Col E1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)[1]。隨后發(fā)現(xiàn)在真核生物中也存在天然的反義RNA，特別是發(fā)現(xiàn)了人工構(gòu)建的反義寡核苷酸在真核生物中具有生物學(xué)效應(yīng)以來，反義RNA技術(shù)已成為一種直接有效的人為控制基因表達(dá)的方法，并且倍受生物學(xué)界關(guān)注。

1.1 反義RNA作用機(jī)理

反義RNA主要通過與靶RNA以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合，參與基因表達(dá)調(diào)控。其作用機(jī)理為：①在DNA復(fù)制水平上。反義RNA通過與DNA復(fù)制時的起始引物RNA結(jié)合，阻止RNA引物與模板DNA的結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制。②在轉(zhuǎn)錄水平上。反義RNA可以直接與mRNA5′端互補(bǔ)，阻止轉(zhuǎn)錄。③在翻譯水平上。反義RNA通過與mRNA上的特定序列互補(bǔ)配對而結(jié)合。結(jié)合位置包括起始密碼子AUG、靶mRNA的非編碼區(qū)、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，從而直接或間接地抑制mRNA的翻譯[2]。

1.2 反義RNA技術(shù)的應(yīng)用

目前，反義RNA技術(shù)作為一種重要的基因調(diào)控手段，在植物、病毒、細(xì)菌中得到廣泛應(yīng)用。在植物中最顯著的應(yīng)用是果實(shí)成熟的控制。科學(xué)家通過控制乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶來限制乙烯的合成，從而達(dá)到控制果實(shí)成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反義RNA技術(shù)抑制ACC合成酶的活性，使果實(shí)內(nèi)的乙烯含量被抑制了99.5%。這為果實(shí)的貯藏、加工、運(yùn)輸?shù)忍峁┝诵路椒ā?

反義RNA技術(shù)在植物抗病方面也得到了很好的應(yīng)用。植物病毒是影響植物生長的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在復(fù)制和表達(dá)的過程中都要經(jīng)歷RNA生物合成階段，這為利用反義RNA技術(shù)進(jìn)行抗病毒研究提供了理論依據(jù)。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作為目的基因，成功構(gòu)建了反義基因并獲得了表達(dá)反義基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染癥狀大量減少甚至消失，并且該抗病毒性狀可穩(wěn)定遺傳。

由于抗生素的濫用，細(xì)菌的耐藥性越來越強(qiáng)。為了能夠快速、簡便獲得新的抗菌藥物，反義RNA技術(shù)被應(yīng)用到藥物篩選模型上。2006年科學(xué)家在金黃色葡萄球菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)出了針對單功能脂肪酸合成酶FabF的反義RNA，并構(gòu)建了反義工程菌。研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的反義工程菌對FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特異性抑制劑非常敏感，通過藥物篩選獲得了能夠有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反義RNA技術(shù)尋找新型抗生素解決細(xì)菌耐藥性的問題。

1.3 反義RNA技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

隨著研究的不斷深入，人們對反義RNA技術(shù)也有了比較成熟的認(rèn)識。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，反義RNA技術(shù)具有許多的優(yōu)越性。①反義RNA技術(shù)操作較簡單，適用范圍廣泛。通過靶mRNA的序列就可以合成所需的反義RNA，可用多個反義RNA同時阻斷多個基因的表達(dá)。②特異性強(qiáng)[7]。反義RNA技術(shù)可以有選擇性的迅速抑制目的基因的表達(dá)。該技術(shù)不會對蛋白質(zhì)產(chǎn)生完全抑制，從而能避免致死突變，對細(xì)胞的正常生長影響較小。③安全性高[8]。導(dǎo)入細(xì)胞的反義RNA不能被翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，因此該技術(shù)在基因工程上的應(yīng)用具有很大的安全性。

眾多的因素限制了反義RNA的發(fā)展。主要包括：①成本較高。②靶基因定位困難。由于高等生物的基因組復(fù)雜，對特殊基因的靶向定位很困難。③使用效率問題。反義RNA的堿基序列、含量、靶序列結(jié)合部位和濃度等都會影響其使用效率[9]。

2 RNA干擾技術(shù)

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指與靶mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性地降解靶mRNA的一種基因轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象[10]。這一現(xiàn)象在自然界中廣泛存在，是生物體在進(jìn)化過程中形成的一種進(jìn)化上保守的用來抵御外來基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制。

1990年Napoli等[11]將查爾酮合成酶CHS基因轉(zhuǎn)入到牽?；ㄖ?，試圖獲得開出深紫色花朵的牽?；?，結(jié)果卻得到了白色和斑片狀花朵，即轉(zhuǎn)入的CHS基因和與該基因同源的色素基因的表達(dá)均受到抑制，將這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分別將外源基因albino-1和albino-3轉(zhuǎn)入粗糙脈孢菌（Neurospora）中，也出現(xiàn)了與植物共抑制相同的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，將其稱為基因壓制（Gene quelling）現(xiàn)象。1995年Guo等[13]發(fā)現(xiàn)將秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正義鏈RNA和反義鏈RNA分別注射到線蟲體內(nèi)均會抑制par-1基因的表達(dá)，但當(dāng)時的理論無法解釋這一現(xiàn)象。直到1998年Fire等[10]才解釋了這一現(xiàn)象，即RNAi是由于dsRNA引起的轉(zhuǎn)錄后序列特異性基因沉默，并將其命名為基因沉默（Gene silencing）。

2.1 RNA干擾作用機(jī)理

RNA干擾作用機(jī)理可分為3個過程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)源性或外源性的長dsRNA首先與Dicer酶結(jié)合，形成Dicer-dsRNA復(fù)合物，在Dicer酶的RNase的作用下，長dsRNA被特異性地裂解為21～23 nt siRNA。其5′端為磷酸基，3′端為羥基且含有2個突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解鏈，形成正義鏈和反義鏈，其中的反義鏈可指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）[15]。在siRNA的引導(dǎo)下，RISC通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別具有同源序列的靶mRNA并進(jìn)行剪切，其剪切位點(diǎn)為與siRNA反義鏈互補(bǔ)的第1個核苷酸下游的11或12個核苷酸處，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板，siRNA為引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又產(chǎn)生新的siRNA，如此循環(huán)多次，可以使RNAi的作用進(jìn)一步放大。因此，少量的siRNA可以產(chǎn)生高效的基因沉默效應(yīng)[16]。研究還發(fā)現(xiàn)siRNA除了能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默，還可指導(dǎo)DNA甲基化酶與DNA的特定部位結(jié)合，引發(fā)該特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默[17]。

2.2 RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用

雖然人們對RNA干擾的研究只有短短的十幾年時間，但發(fā)展卻極為迅速，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。①疾病治療上的應(yīng)用。RNA干擾作為一種基因敲除技術(shù)，在腫瘤、病毒感染、遺傳病治療方面得到了廣泛應(yīng)用。An等[18]利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了卵巢癌OVCAR3細(xì)胞IGF-IR基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到人的卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)IGF-IR基因的siRNA能顯著抑制其mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且還能抑制OVCAR3細(xì)胞的增殖。RNA干擾技術(shù)為疾病在基因領(lǐng)域的治療提供了新方法。②作為基因研究的新工具。由于RNA干擾能特異性的抑制目的基因的表達(dá)，根據(jù)其表型等的改變可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一種有效的手段[19]。Yu等[20]通過構(gòu)建cyclin D1基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，研究cyclin D1基因?qū)Π毯鄹泶癯衫w維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化。③RNA干擾技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于信號傳導(dǎo)通路的研究。通過和傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)結(jié)合，RNA干擾技術(shù)可以很容易確定復(fù)雜信號傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系[21]。Jin等[22]利用RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)argonaute-1在FMRP參與神經(jīng)元發(fā)育和突觸生長過程中起重要作用，證明FMRP能調(diào)節(jié)信號通路。④藥物的開發(fā)與應(yīng)用。RNA干擾可作為尋找和鑒定新藥物靶標(biāo)的工具。利用RNA干擾技術(shù)可以明顯縮短從鑒定到認(rèn)識藥物靶基因功能的時間，有助于藥物開發(fā)過程中對已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干擾技術(shù)能降低蛋白轉(zhuǎn)移酶9（PCSK9）的表達(dá)量，研究發(fā)現(xiàn)PCSK9表達(dá)量的降低能明顯降低小鼠血清膽固醇水平，說明沉默PCSK9可成為治療高膽固醇的藥物靶點(diǎn)。

2.3 RNA干擾技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

RNA干擾技術(shù)具有以下特點(diǎn)：①高效性。RNAi存在級聯(lián)放大效應(yīng)。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA為模板可以產(chǎn)生新的siRNA，如此循環(huán)多次，可以使RNA干擾的作用進(jìn)一步放大。因此，少量的siRNA可以產(chǎn)生高效的基因沉默效應(yīng)。②特異性。siRNA與靶mRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行結(jié)合，只特異性的誘導(dǎo)靶mRNA的降解。研究表明，即使是一個堿基的錯配，也會影響靶mRNA沉默效率[25]。對mRNA前體幾乎沒有影響，以內(nèi)含子或啟動子構(gòu)成的dsRNA也不產(chǎn)生RNA干擾現(xiàn)象。③可傳播和可遺傳性。RNA干擾效應(yīng)可以在不同細(xì)胞間進(jìn)行傳遞，并且可以傳遞到下一代。Fire等[10]通過將dsRNA注射到線蟲體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)dsRNA可以擴(kuò)散到其他細(xì)胞中，并且在下一代也表現(xiàn)出了RNA干擾現(xiàn)象。

目前，對RNA干擾的研究仍處于初級階段，還有許多問題亟待解決。主要包括：①存在脫靶現(xiàn)象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特異性沉默或表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞的正常生長。②穩(wěn)定性差。siRNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后RNA干擾效應(yīng)持續(xù)數(shù)天后便會消失。③載體的安全性問題。在臨床應(yīng)用上，載體作為外來抗原可激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，使載體失活，甚至可能對機(jī)體造成嚴(yán)重的不良后果[26]。

3 鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)

1983年，鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾轉(zhuǎn)錄因子IIIA中被發(fā)現(xiàn)。隨著研究的不斷深入，人們對ZFP有了進(jìn)一步的了解。1996年Kim等[27]將鋅指結(jié)構(gòu)域與IIs型限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域融合，獲得了具有識別特性的人工合成的核酸內(nèi)切酶。隨后，Bibikova等[28]利用ZFN技術(shù)對爪蟾的卵母細(xì)胞開展外源DNA修復(fù)試驗(yàn)，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技術(shù)成功敲除了果蠅的一個內(nèi)源基因。ZFN技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了對基因的高效定點(diǎn)修飾，對研究基因的功能具有重要意義。

3.1 ZFN的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

ZFN是由鋅指蛋白（ZFP）結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶（FokⅠ）的切割結(jié)構(gòu)域兩部分組成[27]。ZFP結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識別并特異結(jié)合靶DNA序列。FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)切割靶DNA。

ZFP結(jié)構(gòu)域一般是由3～6個Cys2-His2型的鋅指結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成，多個鋅指結(jié)構(gòu)的串聯(lián)不僅可識別較長的靶DNA序列，還可以增加其修飾的特異性。每個鋅指折疊成α-β-β（C端-N端）型的二級結(jié)構(gòu)[30]，其中的α螺旋可插入到DNA雙螺旋的大溝，α螺旋中的-1～+6位的7個氨基酸殘基（+4位通常為亮氨酸殘基）決定了對靶DNA識別的特異性[31]。每個鋅指蛋白可識別并結(jié)合一個三聯(lián)體密碼（圖1a）[32]。

FokⅠ是海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）表達(dá)的一種限制性內(nèi)切酶，通過與ZFP的C端融合形成ZFN單體。FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域必須形成二聚體才能發(fā)揮內(nèi)切酶活性[33]。因此，在切割靶位點(diǎn)時，2個ZFN單體按照一定的距離和方向同各自的靶DNA鏈特異結(jié)合，2個FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域恰好可形成有活性的二聚體，在2個結(jié)合位點(diǎn)的間隔區(qū)（Spacer，通常為5～7 bp）切割DNA產(chǎn)生DSB切口。細(xì)胞再通過非同源性末端接合（NHEJ）或同源重組（HR）等方式對基因進(jìn)行修復(fù)，改變靶DNA序列，從而達(dá)到基因敲除的目的[34]（圖1b）。構(gòu)建能特異性識別靶DNA的ZFP結(jié)構(gòu)域是ZFN技術(shù)的關(guān)鍵。因此，只需根據(jù)目的基因設(shè)計出鋅指結(jié)構(gòu)域，再與FokⅠ融合形成ZFNs。然后將融合的ZFNs通過電穿孔、轉(zhuǎn)染及病毒運(yùn)輸?shù)确绞綄?dǎo)入細(xì)胞核中完成對靶基因敲除。

3.2 ZFN技術(shù)的應(yīng)用

ZFN作為一種靶向修飾技術(shù)，可以精確地修飾基因及其周圍調(diào)控元件，在生物體基因組改造與基因功能研究等方面得到廣泛應(yīng)用。ZFN已經(jīng)成功應(yīng)用于線蟲、大鼠、小鼠、中國倉鼠、果蠅、海膽、斑馬魚、家蠶、植物、豬及人類iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞中[35]。主要包括以下兩方面：①對動植物基因組的靶向修飾。Bibikova等[29]利用ZFN技術(shù)對果蠅X性染色體的yellow基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%的雄性果蠅發(fā)生顏色的改變。Zhang等[36]設(shè)計了針對敲除擬南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通過雌激素誘導(dǎo)啟動子表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)T1代分別有7%和16%的植物含有體細(xì)胞突變，并且能穩(wěn)定遺傳給后代。②疾病的治療。Li等[37]利用ZFN技術(shù)治愈了血友病B型小鼠，這為以后利用ZFN技術(shù)治療基因疾病提供了新的有效手段。

3.3 ZFN技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

ZFN作為第一代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)，打破了只能通過同源重組的方式對基因組進(jìn)行改造的觀念。ZFN技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括：①與傳統(tǒng)的方法相比較，ZFN技術(shù)提高了基因組的編輯效率，操作簡單，可以快速敲除目的基因。②能夠廣泛地應(yīng)用于各種生物，并誘導(dǎo)靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。

ZFN技術(shù)也存在著許多的局限性：①存在脫靶現(xiàn)象。由于ZFN對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割時容易脫靶，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。②存在上下文依賴效應(yīng)[38]。ZFN在識別靶DNA位點(diǎn)時，識別靶DNA的重復(fù)氨基酸之間會相互作用，導(dǎo)致識別的特異性發(fā)生改變，即識別靶DNA的特異性不高，影響基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特異性不高，很難設(shè)計出高特異性的鋅指組合，目前該技術(shù)一直被生物公司壟斷。

4 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)

1989年一類可以使植物患病的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黃單胞桿菌（Xanthomonas）中分離得到[39]。2007年Kay等[40]發(fā)現(xiàn)一種TALE蛋白（AvrBs3）可以被黃單胞桿菌注入到宿主細(xì)胞內(nèi)，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞核，與宿主upa20基因的啟動子結(jié)合，激活宿主upa20基因的表達(dá)。2009年Moscou等[41]發(fā)現(xiàn)了TALE蛋白特異結(jié)合宿主基因啟動子的機(jī)制。隨著對TALE蛋白的深入了解，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)TALE蛋白可以補(bǔ)足第一代人工合成的核酸內(nèi)切酶（ZFN）技術(shù)的許多缺陷。2010年Christian等[42]首次報道了人工構(gòu)建的TALEN技術(shù)。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重復(fù)序列進(jìn)行了類似的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FokⅠ結(jié)構(gòu)域連接到TALE結(jié)構(gòu)域的C端的切割效果好于連接到N端。2012年Deng等[44]通過解析TALE蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，清晰揭示了TALE蛋白結(jié)合DNA的作用機(jī)制，為以后更好改造和應(yīng)用TALEN打下了基礎(chǔ)。

4.1 TALEN的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

TALEN是由TALE結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶（FokⅠ）的切割結(jié)構(gòu)域兩部分組成[45]。與ZFN技術(shù)原理類似，TALE結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識別并特異結(jié)合靶DNA序列，F(xiàn)okⅠ的切割結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)切割靶DNA。

TALE蛋白是由N端的具有分泌信號功能的易位結(jié)構(gòu)域（Translocation domain，TD）、中部DNA特異識別結(jié)合域、C端核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Activation domain，AD）4部分構(gòu)成。其中，中部DNA特異識別結(jié)合域是由一系列數(shù)目不定的串聯(lián)重復(fù)單元組成。每個重復(fù)單元通常由34個氨基酸組成[46]，其中32個氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可變化的，這2個氨基酸又被稱為重復(fù)可變雙殘基（Repeat variable diresidue，RVD）。每個重復(fù)單元只識別1個核苷酸，其識別的特異性由RVD決定，并且RVD可與4種堿基有特定的配對關(guān)系，即NI特異識別A，HD特異識別C，NG特異識別T，NH特異識別G，NN對應(yīng)G或A[41，46]。研究發(fā)現(xiàn)，第12位氨基酸主要起穩(wěn)定RVD環(huán)的功能，第13位氨基酸是真正識別特異堿基的氨基酸，決定識別的特異性[44，47]（圖2a）。

FokⅠ與TALE的C端融合形成TALEN。對靶DNA進(jìn)行切割時，F(xiàn)okⅠ也需要形成二聚體發(fā)揮切割作用，當(dāng)兩個TALEN分別結(jié)合到各自的靶DNA序列上時，2個FokⅠ會在靶DNA序列的間隔區(qū)（Spacer，14～18 bp）處形成二聚體[48]，并對靶DNA進(jìn)行切割，形成DSB切口，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的NHEJ和HR修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致基因沉默（圖2b）?？傊ㄟ^構(gòu)建不同的TALE就可實(shí)現(xiàn)對不同靶DNA的切割。

4.2 TALEN技術(shù)的應(yīng)用

TALEN技術(shù)的發(fā)明使得基因組編輯效率明顯提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑馬魚、水稻、擬南芥等物種中得到廣泛應(yīng)用。①遺傳病治療方面的應(yīng)用?？蒲腥藛T利用TALEN技術(shù)對來源β-地中海貧血病人的非整合型iPSCs進(jìn)行珠蛋白基因HBB修復(fù)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在修復(fù)過程中沒有產(chǎn)生TALEN引發(fā)的脫靶突變并且這些修復(fù)好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明這種方法可作為一種治療地中海貧血疾病的有效途徑[50]。②生物模型的構(gòu)建。2014年中國科學(xué)家利用TALEN技術(shù)成功的敲除了食蟹猴基因。首次用該技術(shù)成功構(gòu)建了非人類靈長類動物模型[51]。③新品種的培育。Li等[52]利用TALEN技術(shù)剔除掉了水稻基因組中對水稻白葉枯病敏感基因Os11N3，獲得了穩(wěn)定遺傳的抗病水稻新品種。這也顯示出了TALEN技術(shù)介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修飾在作物遺傳育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.3 TALEN技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

作為第二代人工合成的核酸內(nèi)切酶技術(shù)，與ZFN技術(shù)相比，TALEN技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。①與ZFN技術(shù)相比，TALEN篩選更為簡便，它不需要復(fù)雜的篩選過程，只需要簡單的分子克隆技術(shù)就可以獲得高效的TALEN。②脫靶現(xiàn)象減少，降低了對細(xì)胞的毒性。③切割位點(diǎn)的特異性強(qiáng)。

TALEN技術(shù)雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但也存在許多不足。主要包括：①TALE蛋白較大，并且序列重復(fù)性很強(qiáng)，構(gòu)建表達(dá)載體較為復(fù)雜[53]。一般由生物公司合成，價格較貴。②仍然存在脫靶現(xiàn)象。③一對TALEN只能對一個靶基因進(jìn)行修飾。當(dāng)對多個基因同時進(jìn)行編輯時，需要共轉(zhuǎn)染多個TALEN載體，這樣會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降，很難獲得所需的陽性細(xì)胞[54]。

5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技術(shù)

1987年Ishino等[55]首先在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因下游發(fā)現(xiàn)了成簇的短間隔重復(fù)序列，但該序列當(dāng)時沒有引起人們的足夠重視。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)大約40%的細(xì)菌和90%的古生菌都存在這種成簇的短間隔重復(fù)序列。2002年這種成簇的短間隔重復(fù)序列被命名為串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位點(diǎn)附近還存在著多個與CRISPR相關(guān)的Cas（CRISPR-associated genes）基因。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)，CRISPR中的間隔序列與質(zhì)?；蚴删w等外源DNA序列高度同源。當(dāng)病毒入侵宿主細(xì)胞時，細(xì)菌和古細(xì)菌中的CRISPR序列就能夠引導(dǎo)CRISPR相關(guān)（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，從而起到免疫保護(hù)的作用[58]。

5.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

CRISPR-Cas系統(tǒng)主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白組成[59]。目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)一般被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)在介導(dǎo)靶DNA雙鏈降解時需要多種Cas蛋白的參與，而Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)只需要Cas9就可完成對靶DNA雙鏈的切割[60]。通過比較，Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)更為簡便，更適合應(yīng)用于基因編輯。目前，CRISPR-Cas技術(shù)主要是Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用，本研究將對CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行闡述。

CRISPR序列元件主要是由一個前導(dǎo)序列（Leader）、多個重復(fù)序列（Repeats）及多個間隔序列（Spacers）組成，其中重復(fù)序列和間隔序列以相互交替的方式連接（圖3）。前導(dǎo)序列是一段富含AT，長度為550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可啟動CRISPR序列轉(zhuǎn)錄；重復(fù)序列是一組長度為23～50 bp，平均長度為31 bp的高度保守的短小序列；間隔序列為來源于噬菌體、質(zhì)粒等的平均長度為36 bp的外源基因片段即原間隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一個多結(jié)構(gòu)域蛋白，主要由α-螺旋組成的識別區(qū)（REC）、位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域、 位于氨基末端的RuvC-like結(jié)構(gòu)域以及位于C端的PAM結(jié)合區(qū)組成[62]。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)[63]的作用機(jī)理可分為3個階段：①可變間隔序列的獲得[64]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠識別外源核酸中的特殊片段，該特殊片段中存在原型間隔序列毗鄰基序（Protospacer-associated motif，PAM），并將PAM旁的原型間隔序列加工整合入自身基因組中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前導(dǎo)序列的啟動下CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），隨后CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的tracrRNA（trans- activating crRNA）與pre-crRNA形成RNA異二聚體，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③對外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9結(jié)合形成一個三元的沉默復(fù)合物。而后在crRNA的引導(dǎo)下由Cas9蛋白對目的基因進(jìn)行切割。在切割時Cas9蛋白的HNH能夠特異性識別與crRNA互補(bǔ)配對的模板鏈并對其切割，切割位點(diǎn)位于PAM上游3 nt處；RuvC-1ike參與另一條鏈特定位點(diǎn)的切割，切割位點(diǎn)位于PAM上游3～8 nt處（NGG位點(diǎn)）[65]。Cas9蛋白對外源DNA進(jìn)行切割后也會產(chǎn)生DSB切口，并通過NHEJ和HR的方式進(jìn)行修復(fù)[66]（圖4）。因此，通過設(shè)計不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]將成熟的crRNA和tracrRNA這兩種RNA構(gòu)建成一個向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）與Cas9融合，發(fā)現(xiàn)由sgRNA和Cas9蛋白構(gòu)成的新CRISPR-Cas系統(tǒng)仍可對目的基因進(jìn)行切割。所以，可將CRISPR-Cas9系統(tǒng)簡化成Cas9蛋白與sgRNA。

5.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用

目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用仍處在初級階段，但在基因功能的研究、模式生物的構(gòu)建、遺傳育種等方面得到廣泛應(yīng)用。①在基因功能研究中的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞及生物體的目的基因進(jìn)行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]構(gòu)建了一個含有65 000種sgRNA的文庫，這些sgRNA可以靶向人類基因組中18 080種基因，幾乎涵蓋了每個已知的基因。并將編碼這些sgRNA的基因和編碼Cas9蛋白的基因一起轉(zhuǎn)運(yùn)到人類細(xì)胞中，從而篩選出具有特定功能的基因。②動物模型的構(gòu)建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干細(xì)胞中使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8這5個基因進(jìn)行同時編輯，產(chǎn)生了基因敲除新個體。這為研究基因家族成員的功能相關(guān)性提供新方法。③新品種的改良與培育方面的應(yīng)用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技術(shù)去掉了一個小麥基因，得到了耐白粉病的小麥新品種。還利用CRISPR-Cas9技術(shù)定點(diǎn)突變了水稻和小麥兩種作物的OsPDS和TaMLO基因，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體中基因突變效率為14.5%～38.0%，水稻轉(zhuǎn)基因植物中突變效率4.0%～9.4%，并且在T0代獲得了水稻純合PDS突變體，呈現(xiàn)預(yù)期的白化和矮小表型。

5.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)

作為第三代人工合成的核酸酶，與ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢。主要表現(xiàn)在：①CRISPR-Cas系統(tǒng)的切割能力更強(qiáng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位點(diǎn)[71]。②操作更為簡便，試驗(yàn)周期更短，成本更低。突變不同的靶位點(diǎn)只需設(shè)計與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的sgRNA，然后將sgRNA克隆到表達(dá)質(zhì)粒上即可。③CRISPR-Cas系統(tǒng)可以同時對多個靶基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，因此大大提高了修飾效率。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用仍處于初級階段，存在許多不足：①5′-GN19NGG-3′的結(jié)構(gòu)有時會出現(xiàn)限制性，會對靶位點(diǎn)以外的序列進(jìn)行編輯，產(chǎn)生多余的DNA突變[72]。②CRISPR-Cas系統(tǒng)識別靶序列的長度較短，不能根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)節(jié)。③仍存在脫靶現(xiàn)象。

6 展望

基因功能缺失技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為了研究基因的主要方法。隨著基因功能缺失技術(shù)的不斷更新，已從反義RNA技術(shù)發(fā)展到了CRISPR-Cas技術(shù)，并且其應(yīng)用范圍越來越廣泛，對目的基因的編輯效率越來越高，操作越來越簡便。目前基因功能缺失技術(shù)仍存在許多不足，限制了其發(fā)展。隨著研究的不斷深入與發(fā)展，基因功能缺失技術(shù)必將得到不斷改進(jìn)和完善，也一定會對基因功能方面的研究做出更大的貢獻(xiàn)。

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