食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性

劉博，呂洋，劉軍超，李坤，李秀娟，喬海霞

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000；2河北北方學(xué)院)

食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性

劉博1，呂洋1，劉軍超1，李坤1，李秀娟2，喬海霞2

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000；2河北北方學(xué)院)

目的 探討ASPP2、p53、E-cad在食管鱗癌組織中的表達(dá)，分析其與預(yù)后的相關(guān)性。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)136例食管鱗癌及37例正常食管黏膜組織中ASPP2、p53、E-cad的陽(yáng)性表達(dá)情況，分析其與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系，采用單因素Kaplan-Meier法及Cox多因素比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析ASPP2、p53、E-cad的表達(dá)與患者術(shù)后生存的關(guān)系。結(jié)果 ASPP2、p53、E-cad在食管鱗癌組織中的陽(yáng)性率分別為49.3%、89.7%、46.3%，在正常食管黏膜組織中的陽(yáng)性率分別為94.6%、21.6%、78.4%(P均<0.05)。ASPP2、p53、E-cad的異常表達(dá)均與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，ASPP2、E-cad的異常表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)和TNM分期有關(guān)，E-cad的異常表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05或<0.01)。食管鱗癌組織中，ASPP2與p53呈負(fù)相關(guān)，ASPP2與E-cad呈正相關(guān)，p53與E-cad呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.295、0.620、-0.169，P均<0.05)。ASPP2、E-cad是影響食管鱗癌術(shù)后生存的獨(dú)立因素。結(jié)論 ASPP2、p53、E-cad異常表達(dá)在食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能起協(xié)同作用，且ASPP2、E-cad與食管鱗癌的預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)ASPP2、p53、E-cad有助于判斷食管鱗癌患者的預(yù)后。

食管鱗狀細(xì)胞癌；p53凋亡刺激蛋白；p53；上皮型鈣黏蛋白；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

食管癌是常見(jiàn)的上消化道惡性腫瘤。食管鱗癌是食管癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型[1]。p53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族[2，3]是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與腫瘤相關(guān)的基因家族，由ASPP1、ASPP2和ASPP家族抑制成員(iASPP)共同組成。其中ASPP2是迄今為止發(fā)現(xiàn)的ASPP家族中結(jié)構(gòu)最完整的蛋白質(zhì)[4]。ASPP2與p53關(guān)系密切，二者結(jié)合能夠特異性增強(qiáng)凋亡基因的表達(dá)[5]。上皮型鈣黏蛋白(E-cad)是一種Ca2+依賴(lài)性跨膜蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附性，繼而保持組織結(jié)構(gòu)完整性的作用。E-cad亦是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因素[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad蛋白的表達(dá)變化，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系及與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2008年1月～2009年12月行手術(shù)切除的原發(fā)性食管鱗癌患者136例，男91例、女45例，年齡27～80歲、中位年齡61歲?；颊咝g(shù)前均未接受放化療，具有完整的臨床病理及隨訪(fǎng)資料。取手術(shù)切除的癌組織136例作為觀(guān)察組，距癌組織>5 cm的正常食管黏膜組織37例作為對(duì)照組。

1.2 ASPP2、p53、E-cad蛋白檢測(cè) 采用SP免疫組化染色法。取癌組織和正常食管黏膜組織，4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，H2O2封閉，高壓抗原熱修復(fù)。滴加一抗(ASPP2、p53、E-cad的抗體稀釋比例均為1∶100)，4 ℃孵育24 h后滴加二抗，37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 染色結(jié)果判斷 ASPP2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，p53蛋白定位于細(xì)胞核，E-cad蛋白定位于細(xì)胞膜，以出現(xiàn)均勻一致的棕黃色為細(xì)胞染色陽(yáng)性。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，<10%計(jì)0分，10%～<50%計(jì)1分，50%～<75%計(jì)2分，≥75%計(jì)3分；細(xì)胞著色強(qiáng)度無(wú)色計(jì)0分，灰黃色計(jì)1分，金黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分與著色強(qiáng)度評(píng)分相加，0～2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，生存分析采用Kaplan-Meier法，預(yù)后因素分析采用Cox成比例危險(xiǎn)率模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌與正常食管黏膜組織中ASPP2、p53、E-cad蛋白表達(dá)情況比較 食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad的陽(yáng)性率分別為49.3%(67/136)、89.7%(122/136)、46.3%(63/136)，正常食管黏膜組織中的陽(yáng)性率分別為94.6%(35/37)、21.6%(8/37)、78.4%(29/37)，三者在食管鱗癌與正常食管黏膜組織中的表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 ASPP2、p53、E-cad表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 ASPP2、p53、E-cad的異常表達(dá)均與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P均<0.05)，ASPP2、E-cad的異常表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)和TNM分期相關(guān)(P均<0.05)，E-cad異常表達(dá)還與食管鱗癌的浸潤(rùn)深度相關(guān)(P=0.001)。見(jiàn)表1。

表1 ASPP2、p53、E-cad的異常表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 食管鱗癌組織中ASPP2、p53、E-cad表達(dá)的關(guān)系 ASPP2與p53、p53與E-cad在食管鱗癌組織中的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.295、-0.169，P均<0.05)，ASPP2與E-cad呈正相關(guān)(r=0.620，P<0.05)。

2.4 ASPP2、p53、E-cad表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 以死亡時(shí)間及死亡結(jié)局為應(yīng)變量，各因子表達(dá)為自變量，單因素Kaplan-Meier法及Cox多因素比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析ASPP2、p53及E-cad的表達(dá)對(duì)患者生存的影響，結(jié)果顯示，ASPP2和E-cad是影響食管鱗癌術(shù)后生存的獨(dú)立因素(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Cox多因素回歸分析ASPP2、p53、E-cad表達(dá)與患者死亡的關(guān)系

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境及宿主之間一系列多步驟、多因素相互作用的過(guò)程，是導(dǎo)致惡性腫瘤高病死率的主要原因。研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因包括腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因(癌基因)和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因(抑癌基因)。癌基因的激活和抑癌基因的失活決定著腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。作為一種抑癌基因，ASPP2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡并抑制其侵襲。茅慧[7]采用RT-PCR法檢測(cè)10株食管癌細(xì)胞系和1株食管正常上皮永生化細(xì)胞系中ASPP2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，干擾ASPP2基因的表達(dá)可增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的體外增殖能力。卜芳芳[8]采用免疫組化、qRT-PCR及Western blot方法檢測(cè)ASPP2在食管癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在食管癌原發(fā)瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶以及食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著下降，且其低表達(dá)與食管癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ASPP2在食管鱗癌中的表達(dá)顯著低于正常食管黏膜，且其異常表達(dá)與食管鱗癌的組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)；生存分析結(jié)果顯示，ASPP2是影響食管鱗癌預(yù)后的獨(dú)立因素，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

p53可分為野生型和突變型兩種。野生型p53具有負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，它可以檢測(cè)到細(xì)胞基因組的完整性，修復(fù)損傷的DNA，清除有癌變傾向的細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)。ASPP2能夠與野生型p53結(jié)合，產(chǎn)生較強(qiáng)的抑癌作用[9]。本研究顯示，ASPP2與p53在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明ASPP2能夠通過(guò)p53通路誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡增加，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用[10]。

在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中，腫瘤細(xì)胞通常從原發(fā)部位脫落，穿透基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)，再逐步浸潤(rùn)至淋巴或血管中。因此細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的破壞是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。E-cad是廣泛存在于上皮細(xì)胞中的Ca2+依賴(lài)性跨膜糖蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附反應(yīng)，從而保持組織結(jié)構(gòu)完整性。E-cad表達(dá)缺失將降低同種細(xì)胞間的黏附力，從而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、去分化和轉(zhuǎn)移[11]。本研究顯示，E-cad在食管鱗癌組織中的表達(dá)顯著低于正常食管黏膜，且其異常表達(dá)與食管鱗癌的組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)；生存分析顯示，E-cad是影響食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，這與Chai等[12]及Uchikado等[13]的報(bào)道相符。相關(guān)分析顯示，ASPP2與E-cad在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。卜芳芳[8]報(bào)道，下調(diào)內(nèi)源性ASPP2表達(dá)后，E-cad mRNA及蛋白表達(dá)水平下降。本研究結(jié)果與其相符。

綜上所述，ASPP2、p53與E-cad的異常表達(dá)在食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起協(xié)同作用，且ASPP2及E-cad表達(dá)與食管鱗癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)ASPP2、p53與E-cad的表達(dá)有助于判斷患者預(yù)后。

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呂洋(E-mail: yyang2bb@163.com)

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2016-08-18)