肺腺癌組織中RNA結(jié)合蛋白38的表達及意義

尚自強，王洪江，杜同心，王勇濤，馮雪，童瑩

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區(qū)腫瘤防治研究所)

肺腺癌組織中RNA結(jié)合蛋白38的表達及意義

尚自強1，王洪江1，杜同心1，王勇濤1，馮雪2，童瑩1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區(qū)腫瘤防治研究所)

目的 觀察肺腺癌組織中RNA結(jié)合蛋白38(RNPC1)mRNA和蛋白的表達，探討其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 取50例肺腺癌患者的癌組織(觀察組)和對應(yīng)的癌旁組織(對照組)。采用RT-PCR法檢測兩組RNPC1 mRNA相對表達量，Western blot法檢測兩組RNPC1蛋白相對表達量。結(jié)果 觀察組RNPC1 mRNA及蛋白的相對表達量分別為0.357±0.170、0.294±0.149；對照組分別為0.271±0.128、0.206±0.099；觀察組RNPC1 mRNA及蛋白表達量均高于對照組(P均<0.01)。RNPC1 mRNA表達與肺腺癌患者TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，RNPC1蛋白表達與肺腺癌患者浸潤深度、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 RNPC1在肺腺癌組織中呈高表達，在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

肺腫瘤；肺腺癌；RNA結(jié)合蛋白38；腫瘤浸潤；腫瘤分期

肺癌是目前全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，喪失了手術(shù)治療機會。目前興起的分子靶向治療在手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)方式之外開辟了新的治療途徑。RNA結(jié)合蛋白38(RNPC1)是公認的致癌基因，可通過抑制抑癌基因p53的表達，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。國外報道，RNPC1在前列腺癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等多種腫瘤組織中呈高表達，但關(guān)于其在肺腺癌中的表達情況少見報道。

本研究觀察了肺腺癌組織中RNPC1基因及蛋白的表達情況，探討RNPC1基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取2012年10月～2015年6月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的肺腺癌患者50例，男40例、女10例，年齡41～79(64.1±9.6)歲。TNM分期Ⅰ期16例、Ⅱ期16例、Ⅲ期18例，細胞分化程度低分化9例、中分化33例、高分化8例，浸潤深度T1～T2期35例、T3～T4期15例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。術(shù)中取癌組織(觀察組)以及遠隔癌灶5 cm以上癌旁正常組織(對照組)。標本取材后立即置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNPC1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。采用Primer5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。RNPC1上游引物：5′-ACTACCGACGCCTCGCTCAG-3′，下游引物5′-CCCAGATATGCCAGGTTCAC-3′，擴增片段長度約200 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CGCGGGCTCTCCAGAACATCAT-3′，下游引物5′-CCAGCCCCAGCGTCAAAGGTG-3′，擴增片段長度約301 bp。應(yīng)用TRIzol法提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行擴增。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 6 min。取擴增產(chǎn)物5 μL、Marker 3 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，Imaging Lab凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶及內(nèi)參條帶的積分光密度值，以目的基因與內(nèi)參GAPDH積分光密度值的比值作為RNPC1 mRNA的相對表達量。

1.3 RNPC1蛋白表達檢測 采用Western blot法。按照試劑盒說明進行蛋白提取及總蛋白濃度測定。按制膠試劑盒制膠，于12%分離膠及5%濃縮膠上電泳，冰浴中轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫封閉120 min，加入鼠抗人RNPC1單克隆抗體(1∶200，美國Santa Cruz公司)或內(nèi)參β-actin(1∶750)置搖床，4 ℃孵育過夜，孵育二抗(1∶7 500)后使用ECL發(fā)光試劑盒曝光顯影。所得圖像采用Imaging Lab圖像分析軟件進行分析。RNPC1蛋白主要作用由其亞型RNPC1a發(fā)揮，故測定RNPC1a蛋白調(diào)整體積與同一標本內(nèi)參蛋白β-actin調(diào)整體積的比值作為RNPC1蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組RNPC1 mRNA及蛋白表達比較 觀察組和對照組RNPC1 mRNA的相對表達量分別為0.357±0.170、0.271±0.128，RNPC1蛋白的相對表達量分別為0.294±0.149、0.206±0.099，觀察組RNPC1 mRNA及蛋白表達均高于對照組(P均<0.01)。

2.2 RNPC1 mRNA及蛋白表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 RNPC1 mRNA表達與肺腺癌TNM分期、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，RNPC1蛋白表達與肺腺癌浸潤深度、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1 RNPC1 mRNA及蛋白表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

隨著分子靶向治療研究的進展，目前肺癌已有包括EGFR、ALK、KRAS、VEGF基因等分子靶向治療藥物，但這些靶向藥物的最佳適用人群尚不能包含全部肺癌患者，且分子靶向治療藥物存在不良反應(yīng)多、耐受性差、耐藥等不足[1]。因此尋找新的基因靶點，將會豐富肺癌臨床分子靶向治療的選擇。

抑癌基因p53在保護基因組的完整性和預(yù)防癌癥的發(fā)生過程中起重要作用，p53功能缺失是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[2]。RNPC1可通過抑制p53的翻譯發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。p53基因5′端的非翻譯區(qū)(UTR)或3′端的UTR為RNPC1抑制p53表達的區(qū)域[3]。RNPC1定位于20q13[4]，編碼一個RNA結(jié)合蛋白，表達為兩個亞型，即含有239個氨基酸的RNPC1a和含121個氨基酸的RNPC1b[5]。RNPC1a可阻止真核生物起始因子4E(eIF4E)結(jié)合p53 mRNA。它依賴其氨基端結(jié)合在p53 mRNA上，同時其羧基端控制區(qū)與eIF4E結(jié)合，通過這種方式阻止eIF4E與p53 mRNA結(jié)合。其結(jié)果是p53的翻譯起始復(fù)合體被破壞，從而降低p53的翻譯水平[4，6]，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。RNPC1作為公認的致癌基因，其基因位點在多種腫瘤中表達活躍，包括前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、慢性淋巴細胞白血病、食管癌、乳腺癌和胃癌細胞MGC-823[7～13]。本研究結(jié)果顯示，RNPC1 mRNA及蛋白在肺腺癌組織中呈高表達，其表達水平與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無關(guān)。RNPC1 mRNA與腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期關(guān)系密切；RNPC1蛋白與腫瘤浸潤程度及臨床病理分期關(guān)系密切。表明RNPC1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

綜合目前國內(nèi)外相關(guān)報道，絕大多數(shù)研究結(jié)果提示RNPC1對腫瘤的發(fā)生發(fā)展主要起促進作用。然而，Xue等[14]在乳腺癌中的研究與本文結(jié)論相反，他們發(fā)現(xiàn)RNPC1在乳腺癌組織中的表達低于癌旁組織。研究表明，RNPC1可以靶向調(diào)節(jié)p53、MDM2等多個基因，但對這些靶基因的調(diào)節(jié)作用不盡相同。一方面，RNPC1可抑制p53的翻譯促進腫瘤發(fā)生；另一方面，其可通過結(jié)合MDM2基因3′端UTR的多個位點抑制MDM2表達，而MDM2基因編碼的蛋白p90能與p53基因結(jié)合，使p53基因失去正常功能[15]。這或許是RNPC1在不同腫瘤組織中有不同功能的作用基礎(chǔ)。

綜上所述，RNPC1與肺腺癌關(guān)系密切，其高表達提示肺腺癌浸潤深度較深，TNM分期較晚。RNPC1可促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，可能成為人類肺腺癌分子靶向治療的一個潛在靶點。

[1] 劉世青,畢建偉.非小細胞肺癌的分子靶向治療進展[J].山東醫(yī)藥,2010,50(21):102-103.

[2] Vogelstein B, Lane D, Levine AJ. Surfing the p53 network[J]. Nature, 2000,408(6810):307-310.

[3] Zhang J, Cho SJ, SHU L, et al. Translational repression of p53 by RNPC1, a p53 target overexpressed in lymphomas[J]. Genes Dev, 2011,25(14):1528-1543.

[4] Ding Z, Yang HW, Xia TS, et al. Integrative genomic analyses of the RNA-binding protein, RNPC1, and its potential role in cancer prediction[J]. Int J Mol Med, 2015,36(2):473-484.

[5] Shu L, Yan W, Chen X. RNPC1, an RNA-binding protein and a target of the p53 family, is required for maintaining the stability of the basal and stress-induced p21 transcript[J]. Genes Dev, 2006,20(21):2961-2972.

[6] Zhang M, Zhang J, Chen X, et al. Glycogen synthase kinase 3 promotes p53 mRNA translation via phosphorylation of RNPC1[J]. Genes Dev, 2013,27(20):2246-2258.

[7] 季春梅,黃雯,楊年釗,等.RNPC1基因?qū)ξ赴┘毎鸐GC-823增殖、遷移及侵襲的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2016,42(5):507-510.

[8] Varga D, Deniz M, Schwentner L, et al. Ovarian cancer: in search of better marker systems based on DNA repair defects[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(1):640-673.

[9] Labbe DP, Nowak DG, Deblois G, et al. Prostate cancer genetic-susceptibility locus on chromosome 20q13 is amplified and coupled to androgen receptor-regulation in metastatic tumors[J]. Mol Cancer Res, 2014,12(2):184-189.

[10] Du M, Jiao S, Bien SA, et al. Fine-mapping of common genetic variants associated with colorectal tumor risk identified potential functional variants[J]. PLoS One, 2016,11(7):e0157521.

[11] 唐青青,陸偉,張海健,等.白血病中RNA結(jié)合蛋白RNPC1的表達及意義[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2014,8(5):830-833.

[12] Ginestier C, Cervera N, Finetti P, et al. Prognosis and gene expression profiling of 20q13-amplified breast cancers[J]. Clin Cancer Res, 2006,12(15):4533-4544.

[13] Frankel A, Armour N, Nancarrow D, et al. Genome-wide analysis of esophageal adenocarcinoma yields specific copy number aberrations that correlate with prognosis[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2014,53(4):324-338.

[14] Xue JQ, Xia TS, Liang XQ, et al. RNA-binding protein RNPC1: acting as a tumor suppressor in breast cancer[J]. BMC Cancer, 2014,14(1):1-13.

[15] Meng X, Franklin DA, Dong J, et al. MDM2-p53 pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Res, 2014,74(24):7161-7167.

王洪江(E-mail: whj71210@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.015

R734.2

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1002-266X(2017)06-0045-03

2016-08-15)