姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A459細(xì)胞增殖及CDH13甲基化狀態(tài)的影響

趙瑩，李英姿

(徐州市中醫(yī)院，江蘇徐州221009)

姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A459細(xì)胞增殖及CDH13甲基化狀態(tài)的影響

趙瑩，李英姿

(徐州市中醫(yī)院，江蘇徐州221009)

目的 觀察姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)A549細(xì)胞DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)活性和抑癌基因人H-鈣黏蛋白(CDH13)的影響，探討姜黃素的去甲基化機(jī)制。方法 將A549細(xì)胞分為兩組，觀察組加入40 μmol/L姜黃素和培養(yǎng)液，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液。采用MTT法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖能力，RT-PCR方法檢測(cè)CDH13 mRNA表達(dá)，甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)CDH13啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)，酶活性連續(xù)循環(huán)比色法檢測(cè)Dnmt1、Dnmt3b活性。結(jié)果 觀察組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖OD值分別為0.638±0.184、0.859±0.040，觀察組低于對(duì)照組(P<0.05)。兩組CDH13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.64±0.09、0.43±0.12，觀察組高于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組出現(xiàn)甲基化擴(kuò)增條帶，無(wú)去甲基條帶；觀察組除甲基化條帶外，出現(xiàn)去甲基化條帶。觀察組和對(duì)照組每mg核蛋白中Dnmt1的活性分別為(0.153±0.016)、(0.770±0.014)μmol/min，Dnmt3b的活性分別為(0.137±0.020)、(0.179±0.013)μmol/min，觀察組Dnmt1、Dnmt3b活性均較對(duì)照組下降(P均<0.05)。結(jié)論 姜黃素可通過降低Dnmts活性來(lái)抑制CDH13的甲基化狀態(tài)，從而抑制A549細(xì)胞增殖。

非小細(xì)胞肺癌；姜黃素；甲基化轉(zhuǎn)移酶；人H-鈣黏蛋白；細(xì)胞增殖

DNA異常甲基化是誘發(fā)肺癌的重要原因。DNA甲基化是通過三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的催化實(shí)現(xiàn)的，其中Dnmt1、Dnmt3b的轉(zhuǎn)錄和活性增加是引起抑癌基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化的原因之一[1]。由于CpG島甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是一個(gè)可逆轉(zhuǎn)的表觀遺傳學(xué)基因修飾過程，去甲基化修飾可直接恢復(fù)抑癌基因的功能[2]，因此Dnmts成為腫瘤治療的熱點(diǎn)靶向分子。阻斷Dnmts能夠阻止啟動(dòng)子CpG島的甲基化，抑癌基因重新表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。姜黃素是一種有效的抑癌中藥提取物，對(duì)抑癌基因具有潛在的去甲基化作用[3，4]。2015年9月～2016年5月，我們應(yīng)用姜黃素處理非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)A549細(xì)胞，由于A549細(xì)胞中抑癌基因人H-鈣黏蛋白(CDH13)是完全甲基化狀態(tài)[5]，因此以CDH13為信號(hào)，觀察姜黃素的去甲基化效果，同時(shí)觀察Dnmt1、Dnmt3b活性的變化，探討姜黃素對(duì)A549細(xì)胞的去甲基化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞生物所。姜黃素粉劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品(純度為98%，將其加入二甲基亞砜配置成10 mmol/L的溶液，-20 ℃避光存儲(chǔ)，用前加入RPMI1640稀釋至40 μmol/L)、通用型基因甲基化檢測(cè)試劑盒、Dnmt1和Dnmt3b活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海Genmed公司；總RNA提取試劑盒TRIzol Reagent為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA抽提試劑盒為美國(guó)Omega Bio-tec公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基、核蛋白提取試劑盒及實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物合成由南京凱基生物公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。每2日換液1次，每3～4日消化傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。將細(xì)胞分為兩組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。觀察組加入30 mL培養(yǎng)液及40 μmol/L姜黃素30 μL，對(duì)照組加入30 mL培養(yǎng)液。孵育24 h后，棄培養(yǎng)液，重復(fù)以上步驟二次處理細(xì)胞，加入3 mL清洗液清洗。收集細(xì)胞，加入MTT液(5 g/L)10 μL，37 ℃孵育4 h后加入100 μL二甲基亞砜孵育15 min，振蕩器振蕩10 min充分溶解，于分光光度儀上測(cè)定各孔490 nm處的吸光度OD值，減去空白孔的OD值，作為觀察結(jié)果。

1.4 CDH13 mRNA和甲基化檢測(cè)以及Dnmts活力檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。將細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，觀察組加入30 mL培養(yǎng)液及40 μmol/L姜黃素30 μL，對(duì)照組加入30 mL培養(yǎng)液，孵育24 h后，棄培養(yǎng)液；重復(fù)以上步驟二次處理細(xì)胞，加入3 mL清洗液清洗，收集細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 CDH13 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用半定量RT-PCR方法。兩組分別收集1×106個(gè)細(xì)胞，加入TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用CDH13特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參。CDH13引物序列上游5′-GCAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC-3′，下游5′-AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段為393 bp。β-actin引物序列:上游5′-GAGAGGGAACTCGTGCGTGAC-3′，下游5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，退火溫度55 ℃，產(chǎn)物片段為452 bp。取反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析。計(jì)算目的基因與β-actin的光密度比值作為CDH13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3 CDH13啟動(dòng)子CpG島的甲基化檢測(cè) 采用甲基化特異性PCR(MSP)方法。收集兩組細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)鑒定。使用甲基化檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的DNA進(jìn)行磺化修飾和純化，轉(zhuǎn)化后的DNA樣本溶于20 μL TE溶液中，-20 ℃保存。按照甲基化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行MSP檢測(cè)，反應(yīng)體系共25 μL，包括轉(zhuǎn)化后的DNA模板1 μL(100 ng)，15 mL擴(kuò)增液，CDH13甲基化或去甲基化上下游引物各1 μL，雙蒸水7 μL補(bǔ)齊反應(yīng)體系總量至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。CDH13甲基化引物序列:上游5′-TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC-3′，下游5′-GACGTTTTCATTCATACACGCG-3′；CDH13去甲基化引物序列:上游5′-TTGTGGGGTTTGTTTTTTGT-3′，下游5′-AACTTTTCATTCATACACACA-3′。退火溫度54 ℃，產(chǎn)物片段均為243 bp。取反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。以人類胎盤組織DNA經(jīng)甲基化酶SssⅠ轉(zhuǎn)化后作為甲基化的陽(yáng)性對(duì)照，健康人淋巴細(xì)胞DNA作陰性對(duì)照，雙蒸水作空白對(duì)照。

1.4.4 Dnmt1、Dnmt3b活性檢測(cè) 使用核蛋白提取試劑盒提取兩組細(xì)胞中的核蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液蛋白濃度。用Dnmt1、Dnmt3b活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑盒，取20 μg核蛋白檢測(cè)處理前后細(xì)胞中Dnmt1、Dnmt3b的活性。Dnmts的特異性活性=樣本總活性-樣本非特異性活性。1個(gè)單位活性代表Dnmts在37 ℃，pH 8.0條件下，1 min可轉(zhuǎn)移1 μmol S-腺苷甲硫氨酸甲基到半鏈甲基化寡核苷酸分子上。計(jì)算每mg核蛋白所含Dnmts的單位活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 觀察組和對(duì)照組的相對(duì)OD值分別為0.638±0.184、0.859±0.040，觀察組低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 兩組CDH13 mRNA表達(dá)檢測(cè) 觀察組與對(duì)照組CDH13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.64±0.09、0.43±0.12，觀察組高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 兩組CDH13甲基化狀態(tài)比較 見圖1?？瞻讓?duì)照無(wú)甲基化和去甲基化產(chǎn)物；陰性對(duì)照可見去甲基化擴(kuò)增條帶(1u，243 bp)；陽(yáng)性對(duì)照可見甲基化擴(kuò)增條帶(2m，243 bp)。對(duì)照組可見甲基化擴(kuò)增條帶(4m)，無(wú)去甲基條帶；觀察組除甲基化條帶(3m)外，出現(xiàn)去甲基化條帶(3u)。提示CDH13的啟動(dòng)子CpG島在姜黃素的作用下發(fā)生了去甲基化。

注：0為空白對(duì)照，1為陰性對(duì)照，2為陽(yáng)性對(duì)照，3為觀察組，4為對(duì)照組。M為Marker，m為甲基化擴(kuò)增，u為非甲基化擴(kuò)增。

圖1 MSP檢測(cè)細(xì)胞處理前后CDH13基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)

2.4 兩組Dnmts活性比較 觀察組和對(duì)照組每mg核蛋白中Dnmt1的活性分別為(0.153±0.016)、(0.770±0.014)μmol/min，Dnmt3b的活性分別為(0.137±0.020)、(0.179±0.013)μmol/min，觀察組Dnmt1、Dnmt3b活性均較對(duì)照組明顯下降(P均<0.05)。

3 討論

DNA的甲基化和去甲基化修飾是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式。DNA甲基化通過Dnmts催化實(shí)現(xiàn)，其中Dnmt1是主要的維持甲基化酶，Dnmt3b則催化從頭甲基化，它們與正常的胚胎發(fā)育、衰老和腫瘤發(fā)生關(guān)系密切[2]。研究表明，Dnmts在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中呈過度表達(dá)[6]，抑制或選擇性沉默Dnmts可抑制腫瘤生長(zhǎng)[7]。這種表觀遺傳學(xué)調(diào)控是可逆轉(zhuǎn)的，因此尋找有效的去甲基化藥物能夠?yàn)槟[瘤的靶向治療提供新的方向。目前發(fā)現(xiàn)的去甲基化藥物包括核苷類、氨基苯甲酸類、肼類、茶多酚類等，以及中藥中新發(fā)現(xiàn)的砒霜(三氧化二砷)和姜黃素[8]。美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)上市了兩種核苷類去甲基化藥物，用于治療骨髓異常增生類疾病[7]。但由于核苷類對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，影響了其臨床應(yīng)用。姜黃素作為一種低毒的中藥提取物，為尋找低毒高效的抗腫瘤藥物提供了新思路。

姜黃素是從莪術(shù)、姜黃等中草藥中提純出來(lái)的一種植物多酚，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗腫瘤等作用[3]。研究顯示，姜黃素能夠抑制胰腺癌[9]、乳腺癌[10]、結(jié)腸癌[11]、肺癌[12]、肝癌[13]等腫瘤生長(zhǎng)，其抑癌機(jī)制包括調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]、調(diào)控細(xì)胞周期[14]等。姜黃素是一種潛在的去甲基化藥物，其對(duì)抑癌基因的去甲基化作用已引起人們的高度關(guān)注。研究顯示，姜黃素可能具有多靶點(diǎn)的抗腫瘤機(jī)制。Xu等[12]發(fā)現(xiàn)，姜黃素衍生物可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬，促進(jìn)其凋亡，這與抑制Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)，而對(duì)正常肺泡上皮細(xì)胞無(wú)毒性作用。Li等[9]發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過下調(diào)NF-κB及其下游調(diào)控因子抑制人胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。Ke等[14]發(fā)現(xiàn)，姜黃素可下調(diào)Aurora-A，抑制乳腺癌細(xì)胞的有絲分裂，使其停滯在S期及G2/M期，從而阻止乳腺癌肺轉(zhuǎn)移；姜黃素還可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑、長(zhǎng)春瑞濱等化療藥物的敏感性。

本研究應(yīng)用40 μmol/L姜黃素處理A549細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖受到抑制，甲基化特異性PCR提示細(xì)胞中完全甲基化的抑癌基因CDH13啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)部分逆轉(zhuǎn)，CDH13 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平提高。提示姜黃素對(duì)A549細(xì)胞株的抑制作用與其去甲基化作用有關(guān)，在此過程中Dnmt1和Dnmt3b的催化活性下降，說(shuō)明姜黃素可能通過抑制Dnmt1和Dnmt3b的催化活性發(fā)揮去甲基化作用，Dnmts活性下降提示姜黃素在蛋白水平抑制了Dnmts的作用。Liu等[4]研究認(rèn)為，姜黃素的去甲基化作用可能通過與Dnmt1的巰基共價(jià)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的，Dnmt1的甲基轉(zhuǎn)移位點(diǎn)被姜黃素占據(jù)，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)移甲基的效率下降，妨礙了基因啟動(dòng)子的甲基化修飾，從而起到去甲基化作用。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)，姜黃素的衍生物雙去甲氧基姜黃素可以使A549細(xì)胞株中的抑癌基因WIF-1表達(dá)增加，具有較強(qiáng)的去甲基化作用。Chamani等[10]發(fā)現(xiàn)，使用姜黃素衍生物處理肝癌細(xì)胞株后，Dnmts的轉(zhuǎn)錄水平提高，抑癌基因miR-34家族miR-34a、miR-34b和miR-34c的轉(zhuǎn)錄也明顯上升。以上研究表明，姜黃素對(duì)癌細(xì)胞株的去甲基化作用可能是通過多種途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，姜黃素具有去甲基化作用，能夠提高抑癌基因CDH13的表達(dá)，降低甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmts的活性。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抗癌藥物的作用機(jī)制極其復(fù)雜，體外腫瘤細(xì)胞株的研究不能完全復(fù)制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生活狀態(tài)。因此,姜黃素的去甲基化作用還需要更多的實(shí)驗(yàn)支持。此外，姜黃素的生物利用度低、穩(wěn)定性差、在體內(nèi)代謝快等缺陷，在一定程度上影響了其應(yīng)用。姜黃素的多種天然和合成的衍生物，如去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃、含氮雜環(huán)姜黃素等，較姜黃素更穩(wěn)定，抗腫瘤作用也得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[14]。我們下一步的研究將著重于姜黃素及其衍生物在動(dòng)物體內(nèi)的去甲基化作用，期待以姜黃素作為前體的衍生物成為一種高效、低毒的靶向治療藥物，在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

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Effect of curcumin on proliferation and CDH13 methylation status of non-small-cell lung cancer cell line A549

ZHAOYing,LIYingzi

(XuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xuzhou221009,China)

Objective To observe the effect of curcumin on DNA methyltransferase (Dnmts) activity and tumor suppressor gene human H-cadherin (CDH13) in non-small-cell lung cancer (NSCLC) A549 cells and to explore the mechanism of curcumin's demethylation.Methods A549 cells were divided into two groups: the observation group and the control group. Cells in the observation group were cultured with 40 μmol/ L curcumin and the culture medium, while cells in the control group only with the culture medium. MTT assay was used to detect the cell proliferation, and RT-PCR was used to detect the expression of CDH13 mRNA. CpG island methylation status of CDH13 promoter was detected by methylation-specific PCR (MSP), and catalytic activity of Dnmts was detected by enzyme colorimetric determination kit. Results The OD of the observation group was 0.638±0.184, which was lower than that (0.859±0.040) of the control group (P<0.05). The relative expression level of CDH13 mRNA in the observation group was 0.64±0.09, which was higher than that (0.43±0.12) of the control group. There were methylation amplification bands, but no demethylation bands in the control group, and there were both methylation amplification bands and demethylation bands in the observation group. In the observation group and the control group, the activities of Dnmt1 were separately (0.153±0.016) and (0.770±0.014) μmol/min, and the activities of Dnmt3b were (0.137±0.020) and (0.179±0.013) μmol/min, respectively. The activities of Dnmt1 and Dnmt3b in the observation group were lower than those in the control group (allP<0.05). Conclusion Curcumin inhibits the methylation status of CDH13 by decreasing the activity of Dnmts, and thereby inhibits A549 cell proliferation.

non-small-cell lung cancer; curcumin; methyltransferase; human H-cadherin; cell proliferation

江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(YX1230)。

趙瑩(1986-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楹粑滥[瘤的診治。E-mail： njmuzy@126.com

李英姿(1968-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤的中醫(yī)診治。E-mail： lblyz652@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.003

R734.2

A

1002-266X(2017)06-0009-04

2016-08-16)