不同培養(yǎng)基與前處理方法對(duì)副溶血弧菌MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的影響評(píng)估

陳峰，張丹麗，宛寶山，陳晉(.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200433；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.環(huán)境與兒童健康實(shí)驗(yàn)室，上海 200092)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

不同培養(yǎng)基與前處理方法對(duì)副溶血弧菌MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的影響評(píng)估

陳峰1,2a，張丹麗2b，宛寶山1，陳晉1
(1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200433；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.環(huán)境與兒童健康實(shí)驗(yàn)室，上海 200092)

目的 評(píng)估不同培養(yǎng)基及前處理方法在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對(duì)副溶血弧菌鑒定中的影響，并尋求最優(yōu)化條件組合。方法 收集副溶血弧菌40株，分別用血瓊脂平板、TCBS瓊脂平板和雙洗瓊脂平板進(jìn)行培養(yǎng)；用直涂法、擴(kuò)展法(直涂后裂解)和萃取(裂解、萃取后涂靶)法進(jìn)行質(zhì)譜前處理。用SAS軟件建立不同培養(yǎng)基及前處理方法對(duì)該菌質(zhì)譜檢出率影響的logistic回歸分析模型，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 “血瓊脂平板+萃取法”條件組合檢出率最高(100%鑒定到屬，67.5%鑒定到種)；在不使用血瓊脂平板的前提下，“雙洗瓊脂平板+萃取法”條件組合檢出率最高(70%鑒定到屬，37.5%鑒定到種)。在“屬”鑒定水平，前處理方法相同時(shí)，不同培養(yǎng)基的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而培養(yǎng)基相同時(shí)，不同前處理方法的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；直涂法和擴(kuò)展法相對(duì)萃取法的相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)分別為0.66和0.95，檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TCBS瓊脂平板和雙洗瓊脂平板相對(duì)血瓊脂平板的OR分別為0.06和0.10，對(duì)檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，logistic回歸方程Y=2.95-0.41a-0.05b-2.83c-2.35d(a：直涂法；b：擴(kuò)展法；c：TCBS瓊脂平板；d：雙洗瓊脂平板)。在“種”鑒定水平，采用擴(kuò)展法或萃取法，不同培養(yǎng)基的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；采用血瓊脂平板，不同前處理方法的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；直涂法和擴(kuò)展法相對(duì)萃取法的OR分別為0.32和0.55，檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TCBS瓊脂平板和雙洗瓊脂平板相對(duì)血瓊脂平板的OR分別為0.18和0.49，檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，logistic回歸方程Y=0.20-1.15a-0.61b-1.72c-0.72d(a：直涂法；b：擴(kuò)展法；c：TCBS瓊脂平板；d：雙洗瓊脂平板)。結(jié)論 欲提升副溶血弧菌MALDI-TOF MS鑒定效果，合適培養(yǎng)基的選擇優(yōu)于改善蛋白質(zhì)提取的前處理操作。推薦萃取法作為常規(guī)前處理方法，培養(yǎng)基的選擇建議依次為血瓊脂平板、雙洗瓊脂平板和TCBS瓊脂平板。

培養(yǎng)基；前處理方法；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；副溶血弧菌

基質(zhì)輔助激光解吸電離時(shí)間飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、敏感性高、高通量等特點(diǎn)，已常規(guī)應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的鑒定[1-2]。當(dāng)鑒定效果不佳時(shí)，處理方案往往集中在提高蛋白質(zhì)提取效率[3]、樣本離心富集[4]等優(yōu)化前處理方法上。一旦上述方案對(duì)于某些菌株仍沒有奏效，往往束手無策。副溶血弧菌的臨床質(zhì)譜鑒定往往直接挑取選擇性培養(yǎng)基上的菌落，并且副溶血弧菌在TCBS瓊脂平板、雙洗瓊脂平板和血瓊脂平板上的菌落特征呈現(xiàn)粘稠度依次降低，乳化性逐漸上升，差異明顯。故本研究選取該菌種，評(píng)估質(zhì)譜鑒定過程中2個(gè)較常見的實(shí)驗(yàn)條件(培養(yǎng)基和前處理方法)對(duì)其鑒定結(jié)果的影響，并尋求最優(yōu)組合方案。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2016年1月至12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院臨床患者糞便標(biāo)本來源的副溶血弧菌分離株40株，-80 ℃保存菌種。所有菌株均經(jīng)16S rDNA測序[5]鑒定，與NCBI比對(duì)符合率大于99%。

1.2 主要試劑與儀器 甲酸、乙腈和三氟乙酸(美國Sigma-Aldrich公司)；IVD細(xì)菌測試標(biāo)準(zhǔn)品、α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、96孔金屬靶板、Biotyper 3.0鑒定分析軟件MicroflexTM和MALDI-TOF MS儀(德國 Bruker Daltonik公司)；血瓊脂平板(上海伊華醫(yī)學(xué)公司)；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基瓊脂平板(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)、雙洗瓊脂平板或鏈霉素月桂基硫酸鈉亞碲酸鉀瓊脂平板(double wash agar plate, or streptomycin sodium lauryl sulfate potassium tellurite agar plate)和菌種保存管(上?？片敿挝⑸锕?；PCR試劑盒(上海生工公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；BigDye Terminator v3.1測序試劑盒與ABI 310型全自動(dòng)DNA測序儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 不同培養(yǎng)基的培養(yǎng) 將收集的40株副溶血弧菌自菌種保存管接種至血瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)24 h。取復(fù)蘇后單個(gè)菌落分別轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板、TCBS瓊脂平板和雙洗瓊脂平板于35 ℃培養(yǎng)24 h行次代培養(yǎng)。

1.4 質(zhì)譜分析前處理方法 由具有3年以上熟練操作Bruker公司MALDI Biotyper經(jīng)驗(yàn)的人員完成前處理及質(zhì)譜鑒定工作。直涂法：直接涂菌于靶板孔位；擴(kuò)展法：在直涂法的基礎(chǔ)上，取1 μL 70%甲酸水溶液對(duì)靶板上的細(xì)菌進(jìn)行裂解，并室溫干燥；萃取法：挑取菌落至含300 μL去離子水的離心管，加入900 μL乙醇，混勻后20 817×g離心2 min，沉淀以50 μL 70%的甲酸水溶液裂解細(xì)菌菌體，并加入50 μL乙腈萃取蛋白10 min，15 000 r/min離心2 min，取1 μL上清液點(diǎn)樣至96孔金屬靶板，室溫干燥。

1.5 MS鑒定 加1 μL HCCA于上述3種不同前處理方法得到靶板上的樣品表面，室溫干燥，進(jìn)樣至MALDI-TOF MS系統(tǒng)中分析。IVD 細(xì)菌測試標(biāo)準(zhǔn)品用于每一塊金屬靶板質(zhì)譜分析前的儀器參數(shù)校正。參數(shù)設(shè)置：線性，正離子，蛋白質(zhì)峰譜質(zhì)荷比(m/z)范圍2 000 至20 000，激光解吸每孔至少240次。應(yīng)用Biotyper 3.0鑒定分析軟件，顯示前十位鑒定結(jié)果。記錄排名第一位的鑒定結(jié)果和質(zhì)譜評(píng)分(MALDI score)，并根據(jù)Bruker Dahonics公司的Microflex MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果3分制標(biāo)準(zhǔn)(分值2.000～3.000：鑒定結(jié)果“種”水平可信；分值1.700～1.999：鑒定結(jié)果“屬”水平可信；分值≤1.699：鑒定結(jié)果不可信)對(duì)鑒定結(jié)果可信度進(jìn)行解讀。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)分析。不同培養(yǎng)基與前處理方法下“屬”、“種”水平鑒定結(jié)果比較用卡方檢驗(yàn)和logistic回歸分析。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基及前處理方法組合對(duì)副溶血弧菌鑒定率的比較 40株副溶血弧菌經(jīng)不同的培養(yǎng)基與前處理方法組合的檢出率中“血瓊脂平板+萃取法”條件組合最高，“屬”和“種”水平的檢出率分別為100%和67.5%；在不使用血瓊脂平板的前提下，“雙洗瓊脂平板+萃取法”條件組合檢出率最高，“屬”和“種”水平的檢出率分別為70%和37.5%。見表1。

表1 “屬、種”水平的檢出率(%)

注：鑒定到“屬”水平的數(shù)據(jù)中包括鑒定到“種”水平的數(shù)據(jù)。

2.2 不同培養(yǎng)基與前處理方法對(duì)“屬”水平鑒定結(jié)果影響 對(duì)“屬”水平鑒定，前處理方法相同時(shí)，不同培養(yǎng)基的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2；培養(yǎng)基相同時(shí)，不同前處理方法的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。不同前處理方法與培養(yǎng)基對(duì)“屬”水平檢出率影響進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，以萃取法和血瓊脂平板作為參照，logistic回歸方程為Y=2.95-0.41a-0.05b-2.83c-2.35d(a：直涂法；b：擴(kuò)展法；c：TCBS瓊脂平板；d：雙洗瓊脂平板)；直涂法和擴(kuò)展法相對(duì)萃取法的相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)分別為0.66和0.95，檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TCBS瓊脂平板和雙洗瓊脂平板相對(duì)于血瓊脂平板的OR分別為0.06和0.10，檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)“屬”水平檢出率的影響

2.3 不同培養(yǎng)基與前處理方法對(duì)“種”水平鑒定結(jié)果影響 對(duì)“種”水平鑒定，采用直涂法，不同培養(yǎng)基的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；采用擴(kuò)展法，不同培養(yǎng)基的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；采用萃取法，不同培養(yǎng)基的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。不同前處理方法對(duì)“種”水平鑒定結(jié)果影響僅體現(xiàn)在固定選用血瓊脂平板時(shí)，不同前處理方法的選擇對(duì)于檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)“種”水平檢出率的影響

表5 不同前處理方法對(duì)“種”水平檢出率的影響

不同前處理方法與培養(yǎng)基對(duì)“種”水平檢出率影響進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，以萃取法和血瓊脂平板作為參照，logistic回歸方程為Y=0.20-1.15a-0.61b-1.72c-0.72d(a：直涂法；b：擴(kuò)展法；c：TCBS瓊脂平板；d：雙洗瓊脂平板)。直涂法和擴(kuò)展法相對(duì)萃取法的OR分別為0.32和0.55，檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TCBS瓊脂平板和雙洗瓊脂平板相對(duì)血瓊脂平板的OR分別為0.18和0.49，檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

對(duì)于質(zhì)譜鑒定，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致菌株肽質(zhì)量譜有所變化[6]。本研究表明，使用MALDI-TOF MS鑒定副溶血弧菌時(shí)，合適培養(yǎng)基的選擇優(yōu)于改善蛋白質(zhì)提取效率的操作。在“屬”水平，3種瓊脂平板的檢出率依次為血瓊脂平板>雙洗瓊脂平板≥TCBS瓊脂平板，而采用不同的前處理方法來提高蛋白質(zhì)提取程度并未提升副溶血弧菌的檢出率。在“種”水平，3種前處理方法的檢出率順序依次為萃取法>擴(kuò)展法>直涂法，3種瓊脂平板的檢出率依次為血瓊脂平板>雙洗瓊脂平板≥TCBS瓊脂平板。查閱Biotyper 3.0鑒定分析軟件數(shù)據(jù)庫，副溶血弧菌建庫條件組合即為“血瓊脂平板+萃取法”，亦是佐證了本研究的結(jié)論。

影響質(zhì)譜結(jié)果的因素眾多[7]，培養(yǎng)基的選擇僅是上機(jī)前影響因素之一。本研究亦存在不足之處，如樣本量偏少，菌種范圍單一；納入研究的菌株盡管進(jìn)行了測序確認(rèn)，但未深究分子水平的型別不同(包括標(biāo)準(zhǔn)菌株)是否會(huì)否造成蛋白質(zhì)表達(dá)量差異；不同人員操作結(jié)果的重復(fù)性如何等等。以上因素需要進(jìn)一步的研究。就本文結(jié)果，結(jié)合臨床實(shí)際工作，提出以下建議：對(duì)副溶血弧菌的質(zhì)譜分析，應(yīng)以萃取法作為常規(guī)前處理方法；臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)疑似副溶血弧菌進(jìn)行質(zhì)譜鑒定結(jié)果不佳時(shí)，不妨考慮將菌種轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板進(jìn)行4 h的短時(shí)培養(yǎng)[8]；考慮到副溶血弧菌的培養(yǎng)不以血瓊脂平板為初代培養(yǎng)基，且在此前提下“雙洗瓊脂平板+萃取法”條件組合具有最高的檢出率，故建議以MALDI-TOF MS作為主要鑒定手段的實(shí)驗(yàn)室考慮將在用的TCBS瓊脂培養(yǎng)基替換為雙洗瓊脂培養(yǎng)基；諸如疾病預(yù)防控制中心等部門，或是行批量的副溶血弧菌質(zhì)譜分析，建議將菌種傳代至血瓊脂平板培養(yǎng)；對(duì)質(zhì)譜儀的廠方，建議開發(fā)出更新的菌種蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，其培養(yǎng)條件更能貼近臨床一線實(shí)際使用情況，或是對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分層(基本數(shù)據(jù)庫、科研數(shù)據(jù)庫)，數(shù)據(jù)庫仍存在改進(jìn)的空間[9]；一線工作人員應(yīng)增強(qiáng)對(duì)MALDI-TOF MS在臨床微生物鑒定中常見問題的了解，并能熟練選擇合適的對(duì)策[10]，提升質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用效果。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Effects of different culture media and pretreatment methods on the results of MALDI-TOF mass spectrometry for the identification ofVibrioparahaemolyticus

CHENFeng1,2a,ZHANGDan-li2b,WANBao-shan1,CHENJin1
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiPulmonaryHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200433; 2.a.DepartmentofClinicalLaboratory,b.MinistryofEducation-ShanghaiKeyLaboratoryofChildren′sEnvironmentalHealth,XinhuaHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)

Objective To investigate the effects of different culture media and pretreatment methods on the results of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) for the identification ofVibrioparahaemolyticus, and then provide the optimal conditions. Methods Forty strains ofVibrioparahaemolyticuswere collected, and subcultured with the blood agar plate, thiosulfate citrate bile salts sucrose(TCBS) agar plate and double wash agar plate, respectively. The pretreatment methods before mass spectrometry included the smear method, extension method and extraction method. The effects of different culture media and pretreatment methods on the results of MALDI-TOF MS for the identification ofVibrioparahaemolyticuswere analyzed by the logistics regression model and Chi-square test of SAS software. Results The detection rate ofVibrioparahaemolyticuswas the highest in the combination of blood agar plate with the extraction method(genus level: 100%; species level: 67.5%), followed by the combination of double wash agar plate with the extraction method(genus level: 70%; species level: 37.5%). For the genus identification level ofVibrioparahaemolyticus, when the pretreatment method was the same, different culture media produced significantly different detection rates(P<0.01). However, when the culture medium was the same, there was no significant difference in detection rates for different pretreatment methods(P>0.05). The odd ratios(OR) of the smear method and extention method relative to the extraction method were 0.66 and 0.95, respectively, and there was no significant difference in detection rates for them(P>0.05), while the ORs of the TCBS agar plate and double wash agar plate relative to blood agar plate were 0.06 and 0.10, respectively, and there was significant difference in detection rates for them(P<0.05). The logistic regression equation wasY=2.95-0.41a-0.05b-2.83c-2.83d(a: smear method; b: extension method; c: TCBS agar plate; d: double wash agar plate). For the species identification level ofVibrioparahaemolyticus, when the extension method or the extraction method was used, different culture media produced significantly different detection rates(P<0.05). When the blood agar plate was used, different pretreatment methods also produced significantly different detection rates(P<0.01). The ORs of the smear method and extention method relative to the extraction method were 0.32 and 0.55, respectively, and there was significant difference in detection rates for them(P<0.05), while the ORs of the TCBS agar plate and double wash agar plate relative to blood agar plate were 0.18 and 0.49, respectively, and there was significant difference in detection rates for them(P<0.05). The logistic regression equation wasY=0.20-1.15a-0.61b-1.72c-1.72d(a: smear method; b: extension method; c: TCBS agar plate; d: double wash agar plate). Conclusion For improving the detection rate ofVibrioparahaemolyticusby MALDI-TOF MS, the selection of appropriate culture medium is more important than that of the pretreatment method. It is recommended that the extraction method may be as a conventional pretreatment method, and that the optimal medium is the blood agar plate, followed by the double wash agar plate and TCBS agar plate.

culture medium; pretreatment method; MALDI-TOF MS;Vibrioparahaemolyticus

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.07

陳峰，1981年生，男，大學(xué)本科，主管技師，從事微生物檢驗(yàn)工作；張丹麗，1991年生，女，碩士，從事數(shù)據(jù)分析工作。兩位對(duì)本文貢獻(xiàn)等同，共為第一作者。

陳晉，E-mail：chenjindor@gmail.com。

R446.5

A

2017-01-02)