人參皂苷誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6凋亡的機(jī)制

李 祥 徐海霞 沈洪雷 詹 莉

(石嘴山市第一人民醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科，寧夏 石嘴山 753200)

人參皂苷誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6凋亡的機(jī)制

李 祥 徐海霞1沈洪雷 詹 莉

(石嘴山市第一人民醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科，寧夏 石嘴山 753200)

目的 探討人參皂苷誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6凋亡的機(jī)制。方法 培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6，5、10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 0、12、24、48、72 h，膽囊收縮素(CCK)8試驗檢測人參皂苷對細(xì)胞增殖的影響；10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 48 h后，流式細(xì)胞儀檢測人參皂苷對細(xì)胞凋亡的影響；Western印跡檢測與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 隨著時間的延長和濃度的增加，人參皂苷對細(xì)胞的抑制率增加，表現(xiàn)出時間和濃度的依賴性。72 h后，人參皂苷對細(xì)胞的抑制率到了平臺期，用5 μg/ml的人參皂苷處理黑色素瘤B16-BL6細(xì)胞，細(xì)胞的抑制率較低，因此后期選擇10、20、40 μg/ml的人參皂苷為研究對象，用10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 48 h后，各濃度組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞顯著高于對照組，且呈劑量依賴性(P<0.01)。隨著人參皂苷濃度的增加，Bax蛋白表達(dá)量增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)量減少，兩者之間的比例增加，而且呈劑量依賴性。隨著人參皂苷濃度的增加，細(xì)胞色素(Cyt)C和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)含量增加，且呈劑量依賴性。結(jié)論 人參皂苷抑制黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其凋亡機(jī)制可能與Bcl-2家族Bcl-2和Bax兩者之間的比例改變、線粒體膜通透性改變、促使一些凋亡因子的釋放有關(guān)。

人參皂苷；黑色素瘤細(xì)胞；凋亡；線粒體

黑色素瘤具有高的轉(zhuǎn)移力和侵襲力〔1〕，雖然通過手術(shù)、化療等途徑能起到緩解的效果，但黑色素瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，幾乎沒有藥物可以治愈〔2〕。隨著對人參以及同屬植物在抗腫瘤方面活性的研究，人參皂苷在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等方面所發(fā)揮的作用被發(fā)現(xiàn)〔3〕。研究顯示，人參皂苷能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的凋亡〔4〕。本研究擬探討人參皂苷誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。主要試劑和儀器：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Invitrogen Gibco；胰蛋白酶購自美國Sigma；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國BD公司；青鏈霉素購自華北制藥廠；鼠抗人B淋巴細(xì)胞-2(Bcl-2)多克隆抗體購自美國Newmac；兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人細(xì)胞色素C(Cyt C)多克隆抗體、兔抗人細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)多克隆抗體購自美國CST；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國西盟公司；酶標(biāo)儀購自Thermo Labsystems公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6從液氮罐中取出，放入37℃的水浴鍋中溶解，溶解過程中輕搖凍存管，使之在1 min內(nèi)溶解。凍存管中加入含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，1 000～1 200 r/min離心5 min，吸掉上清，細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞，細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，更換培養(yǎng)基。細(xì)胞融合度達(dá)到90%后，用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，1 000 r/min離心5～8 min，除去酶消化液，PBS重懸細(xì)胞，離心后加入細(xì)胞生長液，將細(xì)胞種植于培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 膽囊收縮素8(CCK8)檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6，0.25%的胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心5 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/孔，細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入終濃度為5、10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 0、12、24、48、72 h后，加入10 μl CCK8溶液，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀在波長為450 nm處測定并記錄各組吸光度OD值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取生長至對數(shù)期的黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6，胰酶消化，37℃飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/ml，取1 ml細(xì)胞懸液至離心管中，4℃，1 000 r/min離心8～10 min。棄上清，加入1 ml冰預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，1 000 r/min，離心8～10 min，棄上清，PBS重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，加入Binding Buffer 200 μl重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin-V和PI，避光室溫靜置20 min，加300 μl PBS，用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western印跡檢測蛋白表達(dá) 各個時間點(diǎn)的黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6培養(yǎng)48 h，1 200 r/min離心收集細(xì)胞，裂解液冰上裂解細(xì)胞，14 000 r/min離心，收集上清。按照試劑盒說明提取細(xì)胞蛋白并測定提取的蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，100℃變性5 min。每孔加入50 μl樣品，電泳。電泳結(jié)束后，取出蛋白凝膠，將濾紙、凝膠、聚偏氟丙烯(PVDF)膜、濾紙依次夾好，4℃轉(zhuǎn)膜過夜。取膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗二抗孵育。TBST洗膜3次，顯影，通過Odyssey掃描系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 CCK8檢測人參皂苷對細(xì)胞增殖的影響 5、10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 48 h后，隨著時間的延長和濃度的增加，人參皂苷對細(xì)胞的抑制率增加，表現(xiàn)出時間和濃度的依賴性。72 h后，人參皂苷對細(xì)胞的抑制率達(dá)到平臺期，用5 μg/ml的人參皂苷處理黑色素瘤B16-BL6細(xì)胞，細(xì)胞的抑制率較低，因此后期選擇10、20、40 μg/ml的人參皂苷為研究對象。見圖1。

與0 h比較：1)P<0.01 圖1 人參皂苷對細(xì)胞黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響

2.2 人參皂苷對細(xì)胞凋亡的影響 10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 48 h后，各濃度組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞顯著高于對照組(0 μg/ml)，且呈劑量依賴性(P<0.01)，且以晚期凋亡為主。見表1。

表1 人參皂苷對黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6凋亡的影響±s,%)

與0 μg/ml組比較：1)P<0.01；下表同

圖2 Western印跡檢測不同濃度的人參皂苷對B16-BL6 細(xì)胞Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá)的影響

2.3 人參皂苷對黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6中Bcl-2 家族蛋白的影響 見圖2，表2。10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 48 h后，Western印跡檢測結(jié)果顯示，隨著人參皂苷濃度的增加，Bax蛋白表達(dá)量增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量減少，兩者之間的比例增加，而且呈劑量依賴性。

表2 不同濃度的人參皂苷作用后黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

2.4 人參皂苷對一些凋亡因子的影響 當(dāng)線粒體膜的通透性改變時，就會導(dǎo)致Cyt C、AIF等凋亡因子的釋放，從而啟動凋亡程序。Western印跡檢測結(jié)果顯示，隨著人參皂苷濃度增加，AIF和Cyt C蛋白表達(dá)量增加，表現(xiàn)出劑量依賴性。見圖3，表3。

圖3 Western印跡檢測不同濃度的人參皂苷作用后 B16-BL6細(xì)胞中Cyt C、AIF蛋白的表達(dá)

組別CytCAIF0μg/ml組0157±00090053±000410μg/ml組0243±00101)0108±00051)20μg/ml組0359±00111)0197±00081)40μg/ml組0468±00131)0268±00091)

3 討 論

研究顯示，人參皂苷對腫瘤增殖凋亡及免疫等方面發(fā)揮重要作用，這為從分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)角度研究抗腫瘤提供了一個新的視野〔5〕。雖然人參皂苷具有很廣的抗腫瘤活性，但對于不同的腫瘤細(xì)胞人參皂苷的抗腫瘤機(jī)制是不同的〔6〕。

本研究結(jié)果顯示，人參皂苷對黑色素瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，其抑制率具有時間和劑量依賴性。

Annexin V能與在細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，使其染色，而PI不能通過完整的細(xì)胞膜，因此發(fā)生凋亡的細(xì)胞的細(xì)胞膜不能染色，但PI可以通過中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，可以染色。兩種方法合用，可以將早、中、晚細(xì)胞和壞死細(xì)胞以及正常細(xì)胞區(qū)分出來〔7〕。

Bcl-2存在于線粒體上，對線粒體膜具有調(diào)節(jié)功能，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(PT)與Bcl-2和Bax之間存在緊密的聯(lián)系，Bcl-2家族蛋白與PT孔的組成之間存在一定的關(guān)系，而細(xì)胞凋亡是由PT孔開放直接導(dǎo)致的〔8～10〕。本研究結(jié)果說明人參皂苷引起黑色素瘤細(xì)胞B16-BL624凋亡，可能是通過使Bcl-2和Bax兩者之間的比例改變、對線粒體膜通透性造成影響實現(xiàn)的。

細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜電位下降、通透性改變，導(dǎo)致Cyt C、AIF等凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而啟動凋亡程序〔11〕。10、20、40 μg/ml的人參皂苷作用于黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6 48 h后，隨著人參皂苷濃度的增加，Cyt C和AIF蛋白的含量增加，且呈劑量依賴性，說明在凋亡過程中Cyt C、AIF存在由線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放。這也提示線粒體在人參皂苷誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

1 劉厚廣,劉 卓,姜 穎,等.慢病毒介導(dǎo)的 CDK2-shRNA 促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞 A375 凋亡〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015；35(22):6345-7.

2 金 訊,買 霞,唐福順,等.蟾蜍靈對惡性黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移及其 VEGF 和 MMP2 表達(dá)的影響〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2015;22(22):1747-53.

3 萬 鳳,司銀楚,牛 欣.人參皂苷作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞對中風(fēng)后神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2016;31(5):1617-24.

4 Wanderi C,Kim E,Chang S,etal.Ginsenoside 20(S)-protopanaxadiol suppresses viability of human glioblastoma cells via down-regulation of cell adhesion proteins and cell-cycle arrest〔J〕.Anticancer Res,2016;36(3):925-32.

5 王 艷,閔鶴鳴,張苗苗,等.人參皂苷 Rg1 對缺氧復(fù)氧 BMSCs 增殖和凋亡的影響〔J〕.中國臨床解剖學(xué)雜志,2015;33(6):655-61.

6 Cheong JH,Kim H,Hong MJ,etal.Stereoisomer-specific anticancer activities of ginsenoside Rg3 and Rh2 in HepG2 cells:Disparity in cytotoxicity and autophagy-inducing effects due to 20(S)-epimers〔J〕.Biol Pharm Bull,2015;38(1):102-8.

7 胡夢裳,張云艷,萬建美,等.不同濃度的碘化丙啶染色對細(xì)胞周期分布的影響〔J〕.激光雜志,2015;36(1):144-7.

8 白 雪,馮 浩,張 柳,等.PP242 對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2 表達(dá)的影響〔J〕.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2016;45(4):324-7.

9 Chen Q,Xu H,Xu A,etal.Inhibition of Bcl-2 sensitizes mitochondrial permeability transition pore(MPTP)opening in ischemia-damaged mitochondria〔J〕.PLoS One,2015;10(3):e0118834.

10 Song S,Jacobson KN,McDermott KM,etal.ATP promotes cell survival via regulation of cytosolic〔Ca2+〕and Bcl-2/Bax ratio in lung cancer cells〔J〕.Am J Physiol-Cell Physiol,2016；310(2):C99-C114.

11 李 成,梁慶威,周志成,等.Bim 在激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及意義〔J〕.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015;44(10):921-5.

〔2016-10-24修回〕

(編輯 袁左鳴)

李 祥(1969-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)康復(fù)方面研究。

R285

A

1005-9202(2017)09-2126-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.019

1 石嘴山市第一人民醫(yī)院藥房