Mac-1基因缺失抑制小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制

段有發(fā) 陳 堅(jiān) 葉志金 王麗京 章倩倩

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣東 廣州 510006)

Mac-1基因缺失抑制小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制

段有發(fā) 陳 堅(jiān) 葉志金 王麗京 章倩倩

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣東 廣州 510006)

目的 探討Mac-1基因缺失對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法 Mac-1基因敲除(Mac-1-/-)小鼠配種擴(kuò)群以獲得實(shí)驗(yàn)需要的數(shù)量，取指數(shù)生長期B16細(xì)胞，分別尾靜脈注射到對照組C57BL/6J小鼠和實(shí)驗(yàn)組Mac-1-/-小鼠體內(nèi)，統(tǒng)計(jì)小鼠生存率及腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，并通過H&E觀察肺組織中微轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果 通過配種擴(kuò)群獲得了大量實(shí)驗(yàn)用純合子Mac-1基因敲除小鼠(Mac-1-/-)。與對照組相比，Mac-1缺失后尾靜脈注射B16細(xì)胞的小鼠存活率顯著提高(P<0.001)；并且大體觀察Mac-1缺失后小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)數(shù)目顯著減少(P<0.001)，抑制率達(dá)到75%；進(jìn)一步通過對肺組織包埋、切片和H&E觀察發(fā)現(xiàn)，Mac-1缺失后小鼠肺組織中腫瘤微轉(zhuǎn)移灶顯著減少(P<0.001)。結(jié)論 Mac-1基因缺失能顯著抑制小鼠黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。

Mac-1缺失；黑色素瘤；肺轉(zhuǎn)移

Mac-1是整合素β2亞族的一個(gè)重要成員，是由α(CD11b)和β(CD18)兩個(gè)亞基以非共價(jià)鍵的方式締合而成的異二聚體。Mac-1主要表達(dá)于白細(xì)胞膜，在粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞表面廣泛表達(dá)，部分淋巴細(xì)胞也有少量表達(dá)，是參與機(jī)體防御作用和免疫反應(yīng)的重要的白細(xì)胞黏附分子，主要影響白細(xì)胞的遷移和組織浸潤〔1,2〕。腫瘤生長微環(huán)境中有大量白細(xì)胞，越來越多的研究表明，腫瘤微環(huán)境中的白細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移〔3～9〕。因此，Mac-1的缺失可能對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有重要影響。目前，Mac-1缺失對黑色素瘤轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚。黑色素瘤是由異常黑色素細(xì)胞過度增生引發(fā)的惡性腫瘤，是皮膚腫瘤死亡病例中的主要類型〔10～16〕。黑色素瘤惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后極差，容易通過血液發(fā)生肺轉(zhuǎn)移〔17〕。本研究利用Mac-1基因敲除小鼠與其背景鼠C57BL/6J建立實(shí)驗(yàn)性黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型，研究Mac-1基因缺失對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃貼壁培養(yǎng)在5% CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞處于指數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Mac-1基因敲除(Mac-1-/-)小鼠12只(雌性和雄性各6只)，7周齡，購于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室；C57BL/6J小鼠20只，雌性和雄性隨機(jī)，6～8周齡，SPF級，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司)。獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具(蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠)；離心機(jī)(Thermo，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；正置顯微鏡、體視顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 Mac-1基因敲除小鼠的配種擴(kuò)群 Mac-1-/-小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，飼養(yǎng)室內(nèi)的溫度維持在(25±3)℃，相對濕度40%～60%，噪音低于60 dB，氨濃度不超過20 ppm，換氣次數(shù)為10～20次/h，自動(dòng)光控時(shí)間為12 h明/12 h暗，飼養(yǎng)室內(nèi)定期用消毒水進(jìn)行清潔消毒。8～12周齡Mac-1-/-小鼠以雄∶雌=1∶3的最佳比例配種，共配兩籠，及時(shí)記錄產(chǎn)仔日期和產(chǎn)仔數(shù)，3周齡時(shí)將仔鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，對小鼠進(jìn)行剪趾編號。

1.3 小鼠實(shí)驗(yàn)性黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型的建立 分別取C57BL/6J小鼠21只和Mac-1-/-小鼠22只，周齡相同，雌性和雄性隨機(jī)。取對數(shù)生長期B16細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用生理鹽水配制成5×108/L的細(xì)胞混懸液。用臺盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞數(shù)在95%以上，通過尾靜脈注射B16細(xì)胞混懸液0.2 ml/只。

1.4 腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的測定 給小鼠尾靜脈注射B16細(xì)胞后，每組取8只小鼠，在第18天時(shí)將小鼠脫頸椎處死，取肺組織，觀察大體形態(tài)并拍照，體視顯微鏡下計(jì)數(shù)腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。

1.5 小鼠生存率統(tǒng)計(jì) 每天觀察統(tǒng)計(jì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)后剩余小鼠的生長生活情況，記錄每只小鼠的自然死亡時(shí)間，并統(tǒng)計(jì)小鼠生存率。

1.6 H&E染色 取注射B16細(xì)胞后18 d處死的小鼠肺組織，固定、脫水后石蠟包埋，切片(3 μm)，脫蠟后蘇木精伊紅染色，鏡下觀察組織形態(tài)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SigmaPlot統(tǒng)計(jì)軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖及進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Mac-1-/-小鼠繁育結(jié)果 Mac-1-/-小鼠按照雄∶雌=1∶3的最佳比例配種，配種兩籠，擴(kuò)大種群，平均每只母鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)為7.5只，共產(chǎn)仔45只。

2.2 Mac-1缺失對B16肺轉(zhuǎn)移小鼠生存率的影響 注射B16細(xì)胞后C57BL/6J小鼠與Mac-1-/-小鼠在23 w開始出現(xiàn)死亡。C57BL/6J小鼠在32 w時(shí)死亡率達(dá)到80%左右，在第40周時(shí)死亡率達(dá)100%；而Mac-1-/-小鼠則在45 w時(shí)死亡率才達(dá)到80%，50 w時(shí)死亡率達(dá)100%(見圖1)。與對照組C57BL/6J小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組Mac-1-/-基因敲除小鼠生存時(shí)間顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.3 Mac-1缺失對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的影響 在注射B16細(xì)胞后第18天處死實(shí)驗(yàn)組Mac-1-/-小鼠和對照組C57BL/6J小鼠，解剖后取肺組織，大體觀察發(fā)現(xiàn)Mac-1-/-小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)顯著少于對照組C57BL/6J小鼠(圖2)；計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)Mac-1-/-小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(11.43±2.24)顯著少于對照組C57BL/6J小鼠(54.86±13.50)(P<0.001)。

H&E染色，鏡下可清楚觀察到肺組織有癌細(xì)胞浸潤，并且Mac-1-/-小鼠黑色素瘤肺組織中微轉(zhuǎn)移灶顯著小于對照組，并且數(shù)目顯著減少。見圖3。

圖1 注射B16細(xì)胞后Mac-1-/-小鼠和 C57BL/6J小鼠生存率觀察

圖2 注射B16細(xì)胞后Mac-1-/-小鼠和 C57BL/6J小鼠轉(zhuǎn)移肺結(jié)節(jié)觀察

圖3 注射B16細(xì)胞后Mac-1-/-小鼠和 C57BL/6J小鼠肺組織H&E染色

3 討 論

Mac-1主要在粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，少量表達(dá)于部分淋巴細(xì)胞〔1〕。Mac-1屬于白細(xì)胞表面的重要黏附分子，可與活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的ICAM-1、ICAM-2等配體高親和力結(jié)合，促使白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞牢固黏附，從而介導(dǎo)白細(xì)胞的游走和滲出〔18,19〕。

腫瘤組織中存在大量白細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用〔9〕。巨噬細(xì)胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子，促進(jìn)腫瘤血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤的生長〔3〕。Wang等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞能夠分泌MMP7，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。有臨床研究表明，在腫瘤組織中，浸潤性巨噬細(xì)胞的數(shù)量越多，則腫瘤血管微密度(MVD)和增殖指數(shù)(PI)越高，腫瘤細(xì)胞的生長越旺盛，腫瘤的預(yù)后越差〔5,20〕。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠分泌血管生成因子，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了營養(yǎng)和通道。另外，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以通過抑制機(jī)體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答來促使腫瘤細(xì)胞逃逸免疫殺傷，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)展〔21,22〕。Nozawa等〔6〕在胰腺瘤模型RIP1-Tag2小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤血管的形成中，浸潤性中性粒細(xì)胞發(fā)揮著“起始開關(guān)”的作用。另外的研究者也報(bào)道了多種腫瘤組織血管的形成與中性粒細(xì)胞密切相關(guān)〔7〕。在黑色素瘤中，巨噬細(xì)胞可以通過產(chǎn)生有絲分裂原、生長因子、酶等促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移〔23〕。Shi等〔24〕在臨床黑色素瘤組織中發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤的惡性程度與浸潤性巨噬細(xì)胞的數(shù)量指數(shù)和血管分級程度呈正相關(guān)。因此，在腫瘤生長的微環(huán)境中，白細(xì)胞能夠分泌各種促血管生成的相關(guān)因子或直接參與血管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管的生成，最終促進(jìn)腫瘤生長〔8〕；或者分泌金屬蛋白酶介質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔9〕。

基因敲除動(dòng)物是目前腫瘤功能基因研究中最理想的動(dòng)物模型。運(yùn)用基因打靶技術(shù)，將無功能的外源基因片段neo轉(zhuǎn)入細(xì)胞，與基因組中的同源序列Mac-1進(jìn)行同源重組，從而把功能性的同源序列置換出來，造成Mac-1功能的完全缺失，最終得到Mac-1基因敲除小鼠〔25〕。Zhang等〔26〕研究報(bào)道，Mac-1缺失通過減少骨髓來源白細(xì)胞的募集抑制腸道腫瘤的生長。Ahn等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)，特異性抗Mac-1的單克隆抗體可以抑制放療后的腫瘤生長而不會出現(xiàn)反跳現(xiàn)象。抑制Mac-1可以降低募集浸潤入腫瘤組織內(nèi)的髓系白細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤血管生成障礙，血供營養(yǎng)不足，使腫瘤生長受到抑制。腫瘤細(xì)胞能夠分泌各種趨化因子，白細(xì)胞在趨化因子的趨化作用下從血管外滲，被募集浸潤入腫瘤組織內(nèi)，進(jìn)而為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移提供幫助〔7〕。

綜上所述，Mac-1在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著正向調(diào)控作用，Mac-1基因的缺失能夠抑制黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。Mac-1基因缺失抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移可能是因?yàn)橐种屏税准?xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能，進(jìn)而影響了白細(xì)胞的遷移和組織浸潤能力，但其作用機(jī)制還不明確，需要進(jìn)一步探討。

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〔2016-11-14修回〕

(編輯 曲 莉)

Inhibitory effect of the gene deletion of Mac-1 on the lung metastasis of mouse melanoma

DUAN You-Fa, CHEN Jian, YE Zhi-Jin,etal.

Vascular Biology Research Institute, School of Basic Courses, Guangzhou Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China

Objective To study the inhibitory effect of the gene deletion of Mac-1 on the lung metastasis of melanoma.Methods Mac-1 knockout mice were mated in order to obtain the number of need. Mice melanoma cells B16 were respectively injected into the caudal vein of the control group C57BL/6J mice and the experimental group Mac-1 knockout mice. The melanoma lung metastasis nodules were examined, survival rate of mice was counted, and micro metastases in lung tissue were observed by H&E.Results A large number of experiments with homozygous Mac-1 knockout mice (Mac-1-/-) were obtained by breeding expansion group. Compared with that of control group, the survival rate of Mac-1 knockout mice with intravenous B16 cells was significantly increased, and the lung nodule number was significantly reduced(P<0.001), and inhibition rate reached 75%, further through the lung tissue embedding, sectioning and H&E observation, tumor metastases of Mac-1 knockout mice was significantly reduced in the lung tissue.Conclusions The gene deletion of Mac-1 could significantly inhibite the lung metastasis of mouse melanoma.

Deletion of Mac-1; Melanoma; Lung metastasis

國家自然科學(xué)基金(No.31471290)；廣東省科技計(jì)劃(No.2015A030302083)；廣州市珠江科技新星(No.201610010045)；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃(No.YQ2015100)

章倩倩(1981-)，女，副研究員，博士，主要從事腫瘤藥理、模式動(dòng)物疾病模型研究。

段有發(fā)(1990-)，男，在讀碩士，主要從事腫瘤藥理、模式動(dòng)物疾病模型研究。

R739.5

A

1005-9202(2017)09-2100-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.008