肉豆蔻總木脂素純化工藝及其抗炎活性研究

張慧，王靜，袁子民，胡娜

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肉豆蔻總木脂素純化工藝及其抗炎活性研究

張慧1，王靜2，袁子民2，胡娜2

1.沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院，遼寧沈陽 110101；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連 116600

目的 優(yōu)化肉豆蔻總木脂素的純化工藝并對(duì)其抗炎活性進(jìn)行研究。方法 采用大孔吸附樹脂法富集純化肉豆蔻總木脂素，以吸附率、解吸率及總木脂素含量為指標(biāo)，考察樹脂型號(hào)、洗脫劑濃度、上樣量及洗脫劑用量等相關(guān)參數(shù)；采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型，通過測(cè)定腫脹度、抑制率考察其抗炎活性。結(jié)果 總木脂素的純化采用AB-8型樹脂，取粗提物干膏1 g溶解后作為上樣液，加入40 mL（含樹脂16 g）預(yù)處理的樹脂，靜態(tài)吸附12 h，上柱，以2 BV/h流速，先用30%乙醇洗脫至無色，再用70%乙醇300 mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液，純度可達(dá)45.8%。肉豆蔻總木脂素高、中、低劑量組的腫脹度與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)論 總木脂素純化工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好，肉豆蔻總木脂素具有明顯的抗炎活性。

肉豆蔻；總木脂素；抗炎

肉豆蔻始載于《本草拾遺》，目前收載于2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）[1]，作為“藥食同源”中藥，主要用于臨床及調(diào)味品香料?，F(xiàn)代研究表明，肉豆蔻中主要含有苯丙素、脂肪油、揮發(fā)油及木脂素等化學(xué)成分，其中總木脂素含量為0.9%～2.2%。木脂素類成分具有抗炎、抗氧化、保肝等藥理作用[2-3]。目前，分離得到的木脂素類成分主要有利卡啉-B、肉豆蔻木脂素及去氫二異丁香酚等[4]。由于總木脂素類成分含量較低，本研究采用大孔吸附樹脂富集純化肉豆蔻總木脂素，并對(duì)其抗炎活性進(jìn)行研究，為肉豆蔻總木脂素的深入研究及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

U-3010紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；AR2140型萬分之一電子分析天平，上海奧豪斯公司；KQ3200超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

肉豆蔻（批號(hào)140915），購于大連權(quán)健中藥飲片有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻Houtt.的干燥成熟種仁；去氫二異丁香酚對(duì)照品（批號(hào)11838-201102，供含量測(cè)定用），中國食品藥品檢定研究院；阿司匹林（批號(hào)20130618），沈陽延風(fēng)制藥有限公司；二甲苯（批號(hào)20110423），遼寧新興試劑有限公司；乙醇等試劑均為分析純，水為蒸餾水；D-101（非極性）、AB-8（弱極性）、DM-301（中極性）大孔吸附樹脂，安徽三星科技有限公司。

SPF級(jí)KM小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，4～6周齡，雌雄各半，遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（遼）2010-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 總木脂素含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取去氫二異丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.15 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以甲醇為空白，于275 nm波長處測(cè)定吸光度（A）。以A為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方程＝0.091 2＋0.004 5（＝0.999 7）。結(jié)果表明，去氫二異丁香酚濃度在1.5～9.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[5]。

2.1.3 測(cè)定法 取粗提物或純化后的干膏0.02 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻后過濾，精密量取續(xù)濾液0.5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算總木脂素含量[5]。

2.2 總木脂素純化工藝研究

2.2.1 總木脂素粗提物的制備 取肉豆蔻粗粉200.0 g，加入90%乙醇提取2次，每次1.5 h，加醇量分別為10倍量（第1次）及8倍量（第2次），合并提取液，于-20 ℃冰箱中靜置24 h后取出，趁冷過濾，濾液回收乙醇后，減壓濃縮至約200 mL，再加水稀釋至400 mL，攪勻，4000 r/min離心30 min，棄去上清液，取沉淀物，加水200 mL，超聲分散，得混懸液，加入等體積乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯，50 ℃真空干燥至恒重，得粗提物[6]。

2.2.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 分別取D-101、AB-8、DM-301型大孔吸附樹脂，加乙醇浸泡24 h，再用乙醇洗至洗脫液加適量蒸餾水混合時(shí)無白色渾濁現(xiàn)象，最后用蒸餾水洗至無醇味，備用[7]。

2.2.3 樹脂型號(hào)的確定 分別取“2.2.1”項(xiàng)下粗提物干膏1.0 g各3份，精密稱定，每份加無水乙醇2 mL溶解，加水稀釋至10 mL，搖勻，分別加入40 mL（相當(dāng)于16.0 g干樹脂）3種預(yù)處理的樹脂，攪勻，靜態(tài)吸附12 h后抽濾，取濾液，在275 nm波長處，以甲醇為空白，測(cè)定吸光度，計(jì)算濃度。按照吸附率計(jì)算公式，計(jì)算3種樹脂的吸附率。然后將上述抽濾后得到3種樹脂，分別加入70%乙醇至50 mL，振蕩12 h，抽濾，取濾液，于275 nm波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算濃度。按照解吸率計(jì)算公式，計(jì)算3種樹脂的解吸率。吸附率（%）＝（C0－Ct）/C0×100%；解吸率（%）＝Cj/（C0－Ct）×100%。C0為樣品液的初始質(zhì)量濃度，Ct為吸附后樣品液的質(zhì)量濃度，Cj為解吸附后濾液的質(zhì)量濃度[8]。結(jié)果D-101、AB-8、DM-301型樹脂的吸附率分別為81.19%、79.32%、77.64%，解吸率分別為68.15%、91.31%、87.40%。綜合考慮3種樹脂的吸附率和解吸率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AB-8型樹脂的吸附率與解吸率均良好，故采用AB-8型大孔吸附樹脂用于純化肉豆蔻總木脂素。

2.2.4 洗脫劑濃度篩選 分別取“2.2.1”項(xiàng)下粗提物干膏1.0 g各3份，精密稱定，每份加無水乙醇2 mL溶解，加水稀釋至10 mL，搖勻，分別加入40 mL（相當(dāng)于16.0 g干樹脂）預(yù)處理的AB-8型樹脂，攪勻，靜態(tài)吸附12 h，上柱，以2 BV/h（1 BV為40 mL）的流速，依次用30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，每次洗脫至無色后，更換洗脫劑濃度，洗脫液分別回收乙醇，濃縮，50 ℃減壓干燥至恒重，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測(cè)定吸光度，計(jì)算總木脂素含量。結(jié)果各洗脫液中總木脂素含量分別為0.96、85.90、114.84、2.51 mg。由結(jié)果可知，30%乙醇幾乎不能洗脫出木脂素，50%與70%乙醇均能洗脫出大量木脂素，而90%乙醇洗脫出的木脂素含量明顯減少，故選擇先用30%乙醇洗脫無色后，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液。

2.2.5 加藥量考察 取“2.2.1”項(xiàng)下粗提物干膏0.5、1.0、1.5 g，分別精密稱定，每份加無水乙醇2 mL溶解，加水稀釋至10 mL，搖勻，分別加入40 mL（相當(dāng)于16.0 g干樹脂）預(yù)處理的AB-8型樹脂，攪勻，靜態(tài)吸附12 h，上柱，以2 BV/h的流速，先用30%乙醇洗脫至無色，再用70%乙醇洗脫至無色，回收乙醇，濃縮，50 ℃減壓干燥至恒重，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測(cè)定吸光度，計(jì)算總木脂素含量及洗脫率。結(jié)果洗脫率分別為72.8%、71.2%、66.2%，表明在加藥量為0.5 g和1.0 g時(shí)洗脫率變化不大，而加藥量為1.5 g時(shí)，洗脫率下降為66.2%，故選擇AB-8型樹脂在40 mL時(shí)加藥量為1.0 g。即上樣液濃度為0.1 g/mL（按干膏量計(jì)），上樣量為10 mL。

2.2.6 洗脫劑用量考察 取“2.2.1”項(xiàng)下粗提物干膏1.0 g，精密稱定，加無水乙醇2 mL溶解，加水稀釋至10 mL，搖勻，加入40 mL（相當(dāng)于16.0 g干樹脂）預(yù)處理的AB-8型樹脂，攪勻，靜態(tài)吸附12 h，上柱，以2 BV/h的流速，先用30%乙醇洗脫至無色，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，分別在洗脫100、200、300、400、500 mL時(shí)接取洗脫液10 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，適當(dāng)稀釋后按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測(cè)定吸光度，計(jì)算10 mL中總木脂素含量。結(jié)果分別為6.8、8.7、0.57、0.14、0.041 mg，表明在洗脫200 mL時(shí)，洗脫液中仍然含有大量木脂素類成分，洗脫300 mL后，洗脫液中的總木脂素含量明顯下降。因此，洗脫劑的最佳用量為300 mL。

2.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述優(yōu)化的純化工藝參數(shù)，分別取“2.2.1”項(xiàng)下粗提物干膏1.0 g各3份，精密稱定，每份加無水乙醇2 mL溶解，加水稀釋至10 mL，搖勻，分別加入40 mL（相當(dāng)于16.0 g干樹脂）預(yù)處理的AB-8型樹脂，攪勻，靜態(tài)吸附12 h，上柱，以2 BV/h的流速，先用30%乙醇洗脫至無色，再用300 mL 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，50 ℃減壓干燥至恒重，得純化后的干膏，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總木脂素含量。結(jié)果3批樣品總木脂素含量分別為45.42%、46.94%、44.9%，平均含量為45.78%。表明工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于肉豆蔻總木脂素的純化。

2.3 總木脂素抗炎活性研究

2.3.1 藥物溶液的配制 按純化后干膏折算的原藥材量及小鼠口服給藥的等效劑量，計(jì)算配制濃度。取經(jīng)AB-8型樹脂純化的肉豆蔻總木脂素適量，精密稱定，加2%聚山梨酯80，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)超聲分散，分別配制成濃度為4.55、9.1、18.2 mg/mL的肉豆蔻總木脂素混懸液，作為低、中、高劑量。

2.3.2 對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抗炎作用 取SPF級(jí)KM小鼠50只，隨機(jī)均分為模型組、陽性藥組及肉豆蔻總木脂素低、中、高劑量組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，各組均按0.2 mL/20 g給藥，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水?？瞻捉M灌胃給予2%聚山梨酯80，陽性藥組灌胃給予阿司匹林（0.8 mg/mL）混懸液，肉豆蔻總木脂素低、中、高劑量組按“2.3.1”項(xiàng)下相應(yīng)濃度混懸液灌胃給藥，1次/d，連續(xù)5 d。末次給藥1 h后，將0.05 mL二甲苯均勻涂抹在各組小鼠右耳廓的正反兩面，以不涂二甲苯的左耳為對(duì)照。致炎腫脹后1 h，將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下左、右兩耳，分別在耳廓同一部位用打孔器打下兩耳片，精密稱定，以左、右耳質(zhì)量差為耳腫脹度[9]，以耳腫脹度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算抑制率[（空白組腫脹度－給藥組腫脹度）÷空白組腫脹度×100%][10]，結(jié)果見表1。與模型組比較，陽性藥組及總木脂素低、中、高劑量組腫脹度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與陽性藥組比較，總木脂素低、中劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），高劑量組無明顯差異（＞0.05）；總木脂素低、中、高劑量組隨給藥劑量的增加，抗炎作用依次增強(qiáng)，其高劑量組抗炎作用與陽性藥組相當(dāng)，表明肉豆蔻總木脂素具有抗炎作用。

表1 肉豆蔻總木脂素對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響（±s）

注：與模型組比較，**＜0.01；與陽性藥組比較，##＜0.01

3 討論

由于肉豆蔻中含有大量脂肪油和揮發(fā)油，木脂素類成分含量較低且難溶于水，因此，在粗提物制備過程中，將醇提液置于-20 ℃冰箱中制冷的作用主要是使脂肪油大量析出，趁冷可以濾除；回收醇后濃縮至約200 mL，再加水稀釋至400 mL，攪勻后離心的目的主要是去除揮發(fā)油及水溶性成分，沉淀物再經(jīng)乙酸乙酯萃取后，可提高總木脂素類成分的含量，便于大孔吸附樹脂的純化。

肉豆蔻中總木脂素的含量大約為0.9%～2.2%，對(duì)于肉豆蔻總木脂素的純化研究，試驗(yàn)中曾考慮采用醇提后制冷，再用乙酸乙酯萃取，但總木脂素的含量只能達(dá)到25%左右，為進(jìn)一步提高總木脂素的純度，試驗(yàn)在原有粗提物制備方法的基礎(chǔ)上，又采用了大孔吸附樹脂純化技術(shù)，使總木脂素的含量達(dá)到45%左右。但如要使其純度達(dá)到50%以上，還需進(jìn)一步深入研究。

抗炎作用實(shí)驗(yàn)研究中，動(dòng)物模型采用二甲苯致小鼠耳腫脹法，通過二甲苯使小鼠耳廓毛細(xì)血管的通透性增加，達(dá)到誘導(dǎo)小鼠耳廓腫脹的目的。

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Study on Purification and Anti-inflammatory Effects of Total Lignans in Myristicae Semen

ZHANG Hui1, WANG Jing2, YUAN Zi-min2, HU Na2

Objective To optimize purification technology of total lignans in Myristicae Semen; To study its anti-inflammatory effects. Methods Macroporous adsorption resin was used for enrichment and purification of total lignans in Myristicae Semen, with adsorption rate, desorption rate and content of total lignans as indexes. The resin type, concentration of eluent, sample weight and dosage of eluen were investigated. Anti-inflammatory effects were studied by determining swelling degree and inhibition rate of mice with ear swelling induced by xylene.Results Purification technology of total lignans was processed on type of AB-8 resin. 1 g crude extract was dissolved as sample; 40 mL preprocessed resin including 16 g resin was added and static adsorpted for 12 hours; 30% ethanol was used firstly to elute to colorless and then 300 mL 70% ethanol was used to elute; the eluent of 70% ethanol was collected. The purity of total lignans was 45.8%. There was statistical significance in ear swelling degree of total lignans in Myristicae Semen high-, medium-, and low-dosage groups compared with model group (<0.05). Conclusion The purification technology of total lignans is stable and reproducible, and total lignans in Myristicae Semen has significant anti-inflammatory activity.

Myristicae Semen; total lignans; anti-inflammatory effects; macroporous adsorption resin

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.021

R284.2；R285.5

A

1005-5304(2017)06-0083-04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81274084）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（201602511）

袁子民，E-mail：yuanzmin@163.com

（2016-10-14；編輯：陳靜）