不同添加物對金針菇幾種胞外酶活性的影響

宋 琪 王爍翔 于魯萌

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

金針菇Flammulina velutipes又名金菇、構(gòu)菌、樸蕈等。金針菇子實(shí)體由細(xì)長而脆嫩的菌柄和形似銅錢的菌蓋組成，呈乳白色或金黃色，蓋滑，柄脆，是世界上產(chǎn)量最高的食用菌之一。金針菇具有食療保健的藥用價(jià)值。有關(guān)金針菇的遺傳育種[1]、同工酶[2]、生物活性物質(zhì)開發(fā)[3]、栽培技術(shù)[4]及液體培養(yǎng)[5]等研究已有報(bào)道，而在其固體培養(yǎng)條件下的特性及胞外酶活性的研究則報(bào)道較少。金針菇的主要栽培基質(zhì)有木屑、棉子殼、廢棉渣、玉米芯，麥草、稻草秸稈等。為促進(jìn)主料的栽培利用，通常添加不同輔料改變主料的碳氮比和微量元素的含量，以適應(yīng)不同食用菌對主料營養(yǎng)的利用[6]。研究是以棉子殼為主要栽培基質(zhì)輔以不同添加物探討了金針菇在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)的特性及其胞外酶的活性變化，確定不同添加物對各種胞外酶分解棉子殼中各種營養(yǎng)物質(zhì)影響的差異，在實(shí)際應(yīng)用中對進(jìn)一步提高栽培技術(shù)有一定的意義。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料金針菇江都18，購自江蘇天達(dá)食用菌研究所。羧甲基纖維素鈉、木聚糖、果膠和半乳糖醛酸為Sigma公司產(chǎn)品，定性濾紙為杭州宮陽特種紙廠生產(chǎn)，其它藥品多為國產(chǎn)分析純。培養(yǎng)基a：棉子殼100%；培養(yǎng)基b：棉子殼90%，淀粉10%；培養(yǎng)基c：棉子殼 98.6%，石膏1%，K2HPO4、KH2PO4各0.2%；培養(yǎng)基d：棉子殼99.8%，尿素0.2%。

1.2栽培方法采用瓶栽方法，按上述培養(yǎng)基配方配比，每瓶折合干料重90 g。根據(jù)配方按料水比1∶1.4將培養(yǎng)基拌勻后，裝入500 mL罐頭瓶。滅菌、接種、栽培管理等方法按常規(guī)方法[7]。

1.3測定方法

1.3.1 酶活測定 在金針菇生長的不同階段：①接種后10 d；②接種后16 d；③接種后22 d；④接種后28 d；⑤原基期；⑥幼菇期；⑦開傘期；⑧采收后第6天，取每種培養(yǎng)基各三瓶，將培養(yǎng)基倒出后充分混勻，取20 g加100 mL純凈水20℃浸提4 h，八層紗布過濾后，1400×g離心10 min，上清液即為粗酶液，另外每種培養(yǎng)基各取20 g在80℃恒溫箱中烘至恒重。

羥甲基纖維素酶（CMC）、濾紙纖維素酶（FP）參照文獻(xiàn)[8]的方法；淀粉酶、果膠酶參照文獻(xiàn)[9]的方法；β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶（HC）、漆酶和過氧化物酶分別參考文獻(xiàn)[10-13]的方法。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 菌絲生長速度 菌絲生長至瓶肩處開始劃線，每五天劃一次，用十字劃線法計(jì)算其生長速度。

1.3.3 組分分析計(jì)算方法 培養(yǎng)基失重和呼吸消耗參照文獻(xiàn)[14]的方法。絕對生物學(xué)效率（%）=子實(shí)體干重（g）/培養(yǎng)基干重（g）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1棉子殼培養(yǎng)基中不同添加物對金針菇三種生物學(xué)性狀的影響

2.1.1 對金針菇菌絲生長速度的影響 由表1可知在不同培養(yǎng)基中，金針菇從接種到菌絲長滿瓶所需要的天數(shù)分別為33、31、32、32 d，添加了淀粉的培養(yǎng)基b菌絲生長速度最快，添加了尿素和石膏的c、d培養(yǎng)基菌絲長勢次之，沒有添加物的培養(yǎng)基a菌絲生長的最慢。說明這些添加物能夠促進(jìn)金針菇菌絲的生長。

2.1.2 絕對生物學(xué)效率與呼吸消耗的影響 金針菇在四種培養(yǎng)基中生長40～50 d，可以長出子實(shí)體并獲得第一潮菇，據(jù)此可得第一潮菇的絕對生物學(xué)效率。在培養(yǎng)基a上生長時(shí)培養(yǎng)基失重19.20%，其中5.02%轉(zhuǎn)化為子實(shí)體生物量；在培養(yǎng)基b上生長時(shí)培養(yǎng)基失重19.09%，其中4.37%轉(zhuǎn)化為子實(shí)體生物量。在培養(yǎng)基c上生長時(shí)培養(yǎng)基失重24.22%，其中6.31%轉(zhuǎn)化為子實(shí)體生物量。在培養(yǎng)基d上生長時(shí)培養(yǎng)基失重20.11%，其中4.58%轉(zhuǎn)化為子實(shí)體生物量。添加尿素的培養(yǎng)基c的金針菇絕對生物學(xué)效率最高，為6.31%，高于沒有添加物的培養(yǎng)基a。添加淀粉的培養(yǎng)基b和添加石膏及礦質(zhì)元素的培養(yǎng)基d的金針菇絕對生物學(xué)效率沒有多大差異，分別為4.37%和4.58%，明顯比培養(yǎng)基a要低。

表1 不同培養(yǎng)基對金針菇絕對生物學(xué)效率與呼吸消耗的影響

2.2棉子殼培養(yǎng)基中不同添加物對金針菇八種胞外酶活性的影響

2.2.1 不同添加物對CMC酶活性的影響 由圖1可知在菌絲營養(yǎng)生長階段（第10～22天），添加淀粉的培養(yǎng)基b、添加尿素的培養(yǎng)基c、添加石膏的培養(yǎng)基d都能提高CMC酶在棉子殼培養(yǎng)基中的酶活性，但在菌絲生長第22天一直到栽培結(jié)束，這三種添加物對酶活性大小的影響無明顯差異，且變化趨勢具有較好的一致性。只有添加尿素的培養(yǎng)基d在菌絲生長22 d后，CMC酶高些。在整個(gè)栽培過程中，四種培養(yǎng)基中的CMC酶的平均酶活性在子實(shí)體生長發(fā)育階段，高于菌絲營養(yǎng)生長階段。

圖1 不同添加物對CMC酶活性的影響

2.2.2 不同添加物對HC酶活性的影響 由圖2可知，不同添加物對HC酶在整個(gè)栽培過程中的變化趨勢影響不大，但對酶活性大小有一定的影響。在四種培養(yǎng)基中，均是子實(shí)體生長發(fā)育階段平均酶活性高于菌絲營養(yǎng)生長期。不同添加物只是影響了HC酶在子實(shí)體生長發(fā)育階段酶活性峰值出現(xiàn)的先后順序和平均酶活性大小。加入淀粉的培養(yǎng)基b，所測得的HC酶活性高峰在原基期；加入尿素的培養(yǎng)基c，HC酶活性峰值出現(xiàn)在幼菇期，其原基期以后一直到栽培就結(jié)束，酶活性都高于沒有添加物的培養(yǎng)基a；加入石膏的培養(yǎng)基d，在原基期和開傘期出現(xiàn)兩個(gè)酶活性峰值，且從接種后28 d，一直到栽培結(jié)束，HC酶活性明顯高于沒有添加物的培養(yǎng)基a。

圖2 不同添加物對HC酶活性的影響

2.2.3 不同添加物對FP酶活性的影響 由圖3可知，在整個(gè)栽培過程中，同一時(shí)期的FP酶在四種培養(yǎng)基中的酶活性大小，差異不明顯，尤其是在菌絲生長16 d后，一直到栽培結(jié)束，酶活性大小差異并不明顯。只有在菌絲生長初期（10 d左右），相比較只有棉子殼的培養(yǎng)基a，添加淀粉和尿素培養(yǎng)基，提高了FP酶的活性。總體來說，雖然不同添加物，在一定程度上影響了不同階段FP酶活性大小，但并不影響酶活性的大致變化趨勢。

2.2.4 不同添加物對β-葡萄糖苷酶活性的影響 由圖4可知，β-葡萄糖苷酶在四種培養(yǎng)基中的酶活性變化趨勢大致相同。從接種后10 d到栽培結(jié)束，β-葡萄糖苷酶變化差異不大，子實(shí)體生長發(fā)育階段，平均酶活性稍高于菌絲生長期。只有在菌絲生長前期（10 d左右），添加淀粉和尿素提高了β-葡萄糖苷酶在棉子殼培養(yǎng)基中的酶活性，在菌絲生長28 d一直到子實(shí)體成熟期添加了淀粉的培養(yǎng)基b和添加了石膏的培養(yǎng)基d中，β-葡萄糖苷酶活性都低于沒有添加物的培養(yǎng)基a。

2.2.5 不同添加物對果膠酶活性的影響 由圖5可知，在金針菇菌絲營養(yǎng)生長前期（第10～22天）果膠酶活性較高。添加石膏或淀粉能提高果膠酶在此階段的活性，但加入尿素反而使果膠酶在此階段的活性偏低，但在菌絲營養(yǎng)生長后期（第22天）一直到栽培結(jié)束，果膠酶在四種培養(yǎng)基中的活性變化趨勢一致性比較好，同一栽培時(shí)期不同培養(yǎng)基的酶活性大小無明顯差異，同一種培養(yǎng)基在這段時(shí)間內(nèi)果膠酶活性大小更無明顯差異。

2.2.6 不同添加物對淀粉酶活性的影響 由圖6可知淀粉酶在四種培養(yǎng)基中的活性變化趨勢大致相同，即菌絲營養(yǎng)生長階段活性相對較高，子實(shí)體生長發(fā)育階段活性較低?？傮w上隨著栽培時(shí)間的延長，淀粉酶活性逐漸下降，而且較為明顯地是加入淀粉、尿素或石膏能提高淀粉酶在整個(gè)栽培階段的酶活性，尤其是添加淀粉可顯著提高淀粉酶的活性。

圖3 不同添加物對FP酶活性的影響

圖4 不同添加物對β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖5 不同添加物對果膠酶活性的影響

圖6 不同添加物對淀粉酶活性的影響

2.2.7 不同添加物對過氧化物酶活性的影響 由圖7可知過氧化物酶在四種培養(yǎng)基中的活性變化呈時(shí)升時(shí)降的趨勢，但在整個(gè)栽培階段平均酶活性呈下降趨勢，由培養(yǎng)基a和b的變化趨勢可以看出，添加淀粉對過氧化物酶活性大小和變化趨勢影響最小，添加石膏的培養(yǎng)基d中，過氧化物酶活性在整個(gè)栽培階段低于沒有添加物的培養(yǎng)基a。由圖7還可以看出，從原基期到開傘期過氧化物酶活性最低，有時(shí)酶活性降為0。

2.2.8 不同添加物對漆酶活性的影響 由圖8可知，金針菇菌絲營養(yǎng)生長階段添加石膏的培養(yǎng)基d漆酶活性最低。不同培養(yǎng)基的漆酶活性都有高峰出現(xiàn)。培養(yǎng)基a和培養(yǎng)基d在原基期達(dá)到活性高峰。添加尿素使得培養(yǎng)基c在菌絲生長22 d達(dá)漆酶活性高峰。添加淀粉的培養(yǎng)基d漆酶活性在整個(gè)過程中呈遞降趨勢。在菌絲生長10 d和28 d酶活性較高。在子實(shí)體成熟期四種培養(yǎng)基中漆酶活性同時(shí)降到最低值，接近為0。子實(shí)體采摘后漆酶活性又開始上升。但總體來說不同添加物對漆酶活性變化趨勢沒多大影響。只是不同程度上影響到漆酶活性大小及酶活性高峰出現(xiàn)的早晚。

圖7 不同添加物對過氧化物酶活性的影響

圖8 不同添加物對漆酶活性的影響

3討論

向棉子殼中添加淀粉、石膏，不能提高金針菇的絕對生物學(xué)效率，而向棉子殼中添加一定量的尿素，既能促進(jìn)金針菇菌絲生長，也能提高絕對生物學(xué)效率。這可能與氮素有利于菌絲體細(xì)胞中蛋白質(zhì)、核酸、酶和輔酶等生物大分子合成，加速細(xì)胞的代謝水平，促進(jìn)菌絲體對生物大分子的分解、吸收、利用和轉(zhuǎn)化有關(guān)。據(jù)此可推測，在生產(chǎn)實(shí)踐中，當(dāng)以棉子殼為主料栽培金針菇時(shí)，可添加尿素以達(dá)增產(chǎn)目的。

金針菇具有完整的纖維素酶系，金針菇在四種培養(yǎng)基上生長期間，培養(yǎng)基中始終存在CMC酶、FP酶和β-葡萄糖苷酶活性，這不同于人們對玉覃[15]和銀耳[16]等的研究，而與靈芝[17]相似，這說明金針菇胞外纖維素酶系完整。這為金針菇分解纖維素奠定了生理基礎(chǔ)。金針菇的胞外CMC酶、FP酶、β-葡萄糖苷酶在子實(shí)體生長發(fā)育階段具有相對較高的酶活性，這種現(xiàn)象與人們對雙孢蘑菇[18，19]、香菇[20，21]、四孢蘑菇[22]等的一些研究相似。對此的解釋是：金針菇原基形成后，隨著菌絲細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)藏的糖原、海藻糖[23]和菌絲體蛋白[24]等的消耗，內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)已不能滿足子實(shí)體迅速生長發(fā)育的需要。纖維素酶活性的增加可加速其對培養(yǎng)基中纖維素降解，滿足子實(shí)體迅速生長發(fā)育對物質(zhì)和能量的需求。漆酶和過氧化物酶活性均隨栽培時(shí)間的延長逐漸下降，這與金頂側(cè)耳、巴西蘑菇等食用菌的情況相似[25，26]。這表明木質(zhì)素的降解可能隨食用菌栽培時(shí)間的延長逐漸減少。

金針菇的胞外淀粉酶和果膠酶都是在菌絲生長階段活性較高，子實(shí)體發(fā)育期活性較低，據(jù)此可推測，淀粉和果膠在菌絲生長期的降解量可能大于子實(shí)體的生長發(fā)育期，這些胞外酶主要在菌絲生長階段發(fā)揮作用，對子實(shí)體的形成與發(fā)育影響不大。

由圖1～8可知，不同添加物所形成的不同營養(yǎng)環(huán)境對金針菇胞外酶活性大小影響較大，對酶活性的變化趨勢影響較小，這一結(jié)論與人們對香菇[27]胞外酶活性的研究結(jié)果相似。這表明，在能夠長子實(shí)體的培養(yǎng)基中，菌絲體所處的營養(yǎng)環(huán)境對酶的活性大小影響較大，而對酶的活性變化趨勢影響較小。