鋸末牛糞堆肥微生物多樣性的宏基因組學(xué)分析

王慧麗+江娟

摘要：運(yùn)用宏基因組技術(shù)研究不同比例鋸末牛糞堆肥產(chǎn)物中微生物的組成和分布。結(jié)果表明，牛糞與鋸末質(zhì)量比為2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1的3個(gè)堆肥樣本中微生物可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）有較大的差異，其中含量最高的3個(gè)門(mén)的微生物為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，在不同樣本中它們的含量也有較大差異。從屬水平分析，含量最高的是甲基單胞菌屬、噬氫菌屬、固氮菌屬和寡養(yǎng)單胞菌等營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化和合成的菌屬。降解纖維素和木質(zhì)素的也有一定的含量，特別是假單胞菌屬含量較高。經(jīng)過(guò)對(duì)堆肥產(chǎn)物基本性質(zhì)及其微生物的分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)牛糞與鋸末的比例為2 ∶1時(shí)，堆肥樣品中的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化和合成菌屬以及去除污染菌屬都高于其他2個(gè)樣品，堆肥效果較好。

關(guān)鍵詞：牛糞堆肥；宏基因組；微生物；鋸末；可操作分類(lèi)單元（OUT）；分子生態(tài)學(xué)依據(jù)

中圖分類(lèi)號(hào)： S141.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0028-05

近年來(lái)，由于產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速。以生產(chǎn)牛奶為主的奶牛養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，但是同時(shí)也帶來(lái)了大量的牛糞等固體有機(jī)廢棄物，為了保護(hù)環(huán)境、實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須進(jìn)行牛糞的無(wú)害化處理和資源化利用，堆肥處理是目前有機(jī)固體廢物處理的重要方式。堆肥的本質(zhì)是微生物群落結(jié)構(gòu)演替協(xié)同作用于堆肥基質(zhì)的生化過(guò)程[1-2]。在細(xì)菌和真菌等微生物的作用下，降解有機(jī)物，殺死病原菌，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定化和腐殖化，最終達(dá)到無(wú)害化和資源化的目的，并生成大量可被植物吸收利用的有效態(tài)氮、有效態(tài)磷、有效態(tài)鉀化合物和其他有機(jī)物質(zhì)作為土壤肥力活性物質(zhì)。因此，研究微生物的群落結(jié)構(gòu)對(duì)于了解微生物的協(xié)同關(guān)系、調(diào)控堆肥以及研究高效穩(wěn)定的復(fù)合菌系都有重要意義。堆肥過(guò)程中的微生物菌系復(fù)雜，變化較大，而且其中大多數(shù)菌系不能分離培養(yǎng)，因而常規(guī)的試驗(yàn)方法和手段難以完全認(rèn)識(shí)和真實(shí)反映微生物的群落組成[3-4]。宏基因?qū)W技術(shù)分析克服了傳統(tǒng)微生物分析僅限于可分離培養(yǎng)組分的缺陷，通過(guò)對(duì)樣品中微生物基因序列的分析，可以快速確定微生物的種類(lèi)和豐度，主要采用16S rDNA序列分析進(jìn)行微生物的群落分析檢測(cè)出樣品中大量的低豐度生物。目前，宏基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于海洋、土壤、石油以及人體胃腸道等多個(gè)方面[5-7]，但用于堆肥研究的較少。在牛糞堆肥中，通常以農(nóng)作物秸稈、木質(zhì)、鋸末廢棄物等作為輔料，起到加速堆肥過(guò)程和保證堆肥效果的作用[8]。本研究就地取材，在牛糞中添加不同比例的鋸末，采用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)不同比例鋸末添加產(chǎn)生的微生物進(jìn)行對(duì)比分析，旨在明確堆肥微生物的群落組成，合理評(píng)價(jià)堆肥效果，為堆肥工藝研究應(yīng)用提供一定的分子生態(tài)學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1堆肥試驗(yàn)及樣品采集

試驗(yàn)所用的牛糞和鋸末分別從湖南省武漢市南湖養(yǎng)殖場(chǎng)和永宏木材加工廠收集（鋸末作為調(diào)節(jié)劑）。堆肥試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，以鋸末為調(diào)理劑，與牛糞充分混合后進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，設(shè)置柱體高度為0.8 m，直徑為0.5 m，實(shí)行人工翻堆通氣，每3 d進(jìn)行1次手工翻堆。在3個(gè)相同的堆肥容器內(nèi)，將牛糞與鋸末分別按照2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1比例混合，堆肥45 d時(shí)取樣，分別在每個(gè)柱體的上、中、下采集樣品，然后將3個(gè)取樣點(diǎn)的樣品混合為1個(gè)樣品，3個(gè)堆肥容器所取的樣品分別編號(hào)為1、2、3號(hào)樣品。

1.2宏基因組DNA的提取和16S rDNA測(cè)序

對(duì)3個(gè)樣本采用MIO-BIO的PowerSoil DNA Isolation Kit進(jìn)行基因組DNA抽提，分別取3 μL進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

根據(jù)illumina Miseq高通量測(cè)序要求，進(jìn)行雙向測(cè)序，設(shè)計(jì)16S V4～V5區(qū)域和帶有5′Miseq接頭-barcode-測(cè)序引物-特異引物-3′的融合引物。細(xì)菌16S V4～V5引物序列如下：515F，5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-

NNNNNNNN-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGC

CAGCMGCCGCGGTAA-3′；926R，5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′。文庫(kù)構(gòu)建采用2步PCR擴(kuò)增的方法：首先采用特異引物擴(kuò)增目的片段，將目的片段進(jìn)行膠回收，而后將回收產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，目的是將illumina平臺(tái)測(cè)序所需的接頭、測(cè)序引物和barcode添加到目的片段的兩端。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)效果好的樣品于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，取 3 μL 回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，微量熒光核酸定量?jī)x和Qubit 3.0試劑進(jìn)行定量，均一化混勻后送樣到上海微基生物公司測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)分析方法

1.3.1測(cè)序獲得序列的質(zhì)量控制在試驗(yàn)過(guò)程中，測(cè)序產(chǎn)物可能含有非特異性擴(kuò)增片段，利用特異性引物信息可以將其去除；序列中可能含有模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)以及PCR過(guò)程中產(chǎn)生的一些嵌合體，將這些序列納入分析范圍會(huì)降低分析質(zhì)量，因此去除此部分序列，可得到供精準(zhǔn)分析的優(yōu)化序列。

1.3.2可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）分析首先提取非重復(fù)序列，堿基完全一致序列為重復(fù)序列只保留1條；然后與SILVA v119數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arb-silva.de/）中的aligned（16S/18S，SSU）核糖體序列比對(duì)[9]，使用uchime軟件檢測(cè)PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的嵌合體序列（Chimeric序列）并去除嵌合體序列；最后使用mothur V.1.33.3軟件進(jìn)行距離計(jì)算與OTU聚類(lèi)分析[10]。OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中為了便于分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。要了解一個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就須要對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)操作（cluster）。通過(guò)聚類(lèi)操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，1個(gè)小組就是1個(gè)OTU?？筛鶕?jù)不同的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，通常在97%的相似水平下對(duì)OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。在進(jìn)行OTU分類(lèi)學(xué)分析時(shí)，首先將每一條優(yōu)質(zhì)序列都與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出其最相近且可信度達(dá)80%以上的種屬信息；之后將每一個(gè)OTU中的所有序列進(jìn)行類(lèi)比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先的種屬信息。將OTU綜合分類(lèi)表中的信息按照門(mén)、綱、目、科、屬、種6個(gè)水平分別提取信息，分別統(tǒng)計(jì)各樣品在不同分類(lèi)水平上的相對(duì)豐度。

1.3.3分級(jí)發(fā)育樹(shù)在前述分類(lèi)學(xué)分析中，已經(jīng)得到每個(gè)OTU的豐度和對(duì)應(yīng)的分類(lèi)學(xué)信息，使用軟件MEGAN（http：//ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/）導(dǎo)入分析數(shù)據(jù)中樣品包含的物種及物種豐度[11]，通過(guò)交互式搜索NCBI的分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以樹(shù)狀圖形式表現(xiàn)物種的豐度情況和群落結(jié)構(gòu)，反映微生物的組成情況。這種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)不同于利用序列堿基差異構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，不能反映物種間的時(shí)間進(jìn)化信息。

1.3.4系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)在分子進(jìn)化研究中，系統(tǒng)發(fā)生的推斷能夠揭示出有關(guān)生物進(jìn)化過(guò)程的順序，了解生物進(jìn)化歷史和機(jī)制，可以通過(guò)序列間堿基的差異構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。選擇OTU的代表序列根據(jù)鄰位比對(duì)法（neighbor-joining）使用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果以列圖或者圈圖的形式呈現(xiàn)。

2結(jié)果與分析

2.1堆肥樣品基本性質(zhì)

針對(duì)堆肥初始和堆肥45 d后的混合料及滲濾液進(jìn)行基本的性質(zhì)檢測(cè)，包括混合料的含水率、pH值、碳氮比，滲濾液的CODCr（化學(xué)耗氧量）和BOD5（生化耗氧量）去除率。同時(shí)，在堆肥45 d后提取稀釋液，注入無(wú)菌去離子水，加入適量浸泡后的種子，在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)1周，觀察種子發(fā)芽率，具體數(shù)值見(jiàn)表1和表2。

初始堆肥料的含水率在55%～65%之間，被認(rèn)為是比較適合堆肥發(fā)酵的條件[12]。因此，1號(hào)樣可能有較好的發(fā)酵條件（表1）。通過(guò)表2可以看出，在堆肥45 d后，3個(gè)樣品均達(dá)到了基本腐熟化，種植發(fā)芽率均>50%。1號(hào)樣中滲濾液CODCr和BOD5的去除率、種子發(fā)芽率較高。

2.2宏基因組DNA的提取

DNA提取是微生物種群分析的先決步驟，提取純度將影響后續(xù)的試驗(yàn)和分析。試驗(yàn)對(duì)3個(gè)樣本進(jìn)行基因組DNA抽提后，分別取3 μL進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1-A。其中，從上至下條帶依次為9 000、5 000、3 000、2 000、1 000、500 bp，上樣量為3 μL，亮帶為30 μg/uL，其余條帶均為10 ng/μL，基因組條帶可見(jiàn)，后續(xù)試驗(yàn)根據(jù)濃度加入 5～50 ng進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。

二次PCR擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1-B所示，由此可見(jiàn)，二次PCR擴(kuò)增后條帶單一，亮度適中，可進(jìn)行后續(xù)膠回收試驗(yàn)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)效果好的樣品，于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，取3 μL回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果（圖1-C）顯示，PCR產(chǎn)物回收效果良好。

2.3樣本微生物群落OTU分布

通過(guò)MiSeq測(cè)序，1、2、3號(hào)樣分別獲得了34 317、34 128、35 180條細(xì)菌的16S rDNA序列。利用雙端測(cè)序的成對(duì)序列（pair end reads）間的重疊部分將成對(duì)序列拼接成1條序列，拼接好的全部樣本序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)主要分布在400～450 bp之間。

通過(guò)OTU分析可以獲得不同樣本中微生物群落的種屬信息，筆者測(cè)序的3個(gè)樣本總共獲得了3 677個(gè)OTU類(lèi)別，3個(gè)樣本分別獲得的OTU數(shù)目為1 631、1 867、1 899個(gè)，不同樣本間的交集如圖2所示。

OTU是根據(jù)宏基因組測(cè)序中的序列信息來(lái)獲得可能的物種分類(lèi)信息，一般屬水平的OTU居多。1號(hào)樣在變形菌門(mén)（Proteobacteria）有較多的OTU分布，2號(hào)樣在擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）有較多的OTU分布；3號(hào)樣在變形菌門(mén)（Proteobacteria）有1個(gè)OTU，是3個(gè)樣本所有OUT中含量中最高的，這個(gè)OTU是嗜甲基菌科（Methylophilaceae），這是一種利用甲醇和甲胺為唯一碳源和能源的革蘭陰性桿菌，主要在活性污泥中[13]，這可能與3號(hào)樣中牛糞含量較高有關(guān)。

在這些不同的OTU中發(fā)現(xiàn)了一些有潛在功能并且和堆肥過(guò)程或肥料肥力相關(guān)的微生物類(lèi)別，如能降解纖維素的細(xì)菌噬纖維菌科（Cytophagaceae）在3個(gè)樣本中的豐度分別為0.008 5、0.006 4、0.001 6，特別是噬纖維菌目（Cytophagales）在1號(hào)樣中達(dá)到1%。已報(bào)道的可以降解木質(zhì)素的細(xì)菌中厭氧梭菌（Clostridium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）都有一定的含量[14]，其中厭氧梭菌菌株Clostridium sp. enrichment culture clone VanCtr97在3個(gè)樣本中的含量分別為0.001 9、0002 3、0.001 3；假單胞菌屬（Pseudomonas）在3個(gè)樣本中的含量更是高達(dá)0.034 1、0.008 2、0.014 9。假單胞菌屬是重要的解脂肪菌，能溶解礦物質(zhì)，提供養(yǎng)分供應(yīng)[14-15]，因此假單胞菌屬是堆肥產(chǎn)物肥力的重要組成部分。此外，其他營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化和合成相關(guān)的細(xì)菌[15]，如亞硝化單胞菌（Nitrosomonas sp.）、非共生固氮固氮螺菌（Azospirillum sp.）和共生固氮根瘤菌（Rhizobium sp.）在各個(gè)樣本中都有一定的比例，從 0.000 1～0.008不等。

2.4樣本微生物種群門(mén)和屬水平分布

種屬信息按照分類(lèi)學(xué)水平分為多列，將物種的門(mén)、綱、目、科、屬、種6個(gè)水平的信息及相關(guān)的其他分類(lèi)信息的全部?jī)?nèi)容都進(jìn)行分類(lèi)分析。樣品間可以通過(guò)基于群落組成的層次聚類(lèi)分析（bray-curtis算法）進(jìn)行相似度樹(shù)分析（圖3）。從圖3可以看出，其中門(mén)水平含量最多的5個(gè)細(xì)菌門(mén)類(lèi)及其在1、2、3號(hào)等3個(gè)樣本中的比例分別是：變形菌門(mén)（Proteobacteria），0.694、0.386、0.555；擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），0.174、0.389、0.202；厚壁菌門(mén)（Firmicutes），0.034、0.067、0.083；螺旋菌門(mén)（Spirochaetae），0.017、0.049、0.030；放線菌門(mén)（Actinobacteria），0.016、0.013、0.050。并且這3個(gè)樣本在含量最多的3個(gè)門(mén)類(lèi)細(xì)菌的比例上都有較大差別。門(mén)是非常大的分類(lèi)單元，須要進(jìn)行屬水平的比較小而常用的分類(lèi)單元的細(xì)菌分類(lèi)比較，但是有很多序列不能確定到具體的屬中，3個(gè)樣本分別有42%、70%、58%的OTU不能確定到屬的水平。

已知屬信息的OTU中按豐度排序的前50個(gè)OTU分布如圖4所示，其中能確定屬類(lèi)別的OTU中含量最高的5個(gè)屬及其比列分別是：甲基單胞菌屬（Methylomonas），0.019、0.022、0.049；噬氫菌屬（Hydrogenophaga），0.036、0.018、0.025 9；固氮弧菌屬（Azoarcus），0.069、0.006、0.003；固氮捲菌屬（Azonexus），0.004、0.007、0.033；寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas），0.043、0.003、0.002。這5個(gè)都屬于變形菌門(mén)，其中固氮弧菌屬和固氮捲菌屬都屬于紅環(huán)菌科的固氮菌屬。這5個(gè)含量最高的屬都是屬于營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化和合成的菌屬，如甲基單胞菌屬能利用甲烷、甲醇等含甲基的單碳化合物為碳源和能源，寡養(yǎng)單胞菌可以降解有機(jī)農(nóng)藥，并且同時(shí)將農(nóng)藥轉(zhuǎn)化為生物活性更高的代謝產(chǎn)物[16]。

2.5樣本微生物群落分類(lèi)學(xué)系統(tǒng)樹(shù)分析

將測(cè)序得到的物種豐度信息回歸至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的分類(lèi)學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)中，可以從整個(gè)分類(lèi)系統(tǒng)上全面了解測(cè)序的環(huán)境樣品中所有微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐度差異，圖5是對(duì)已知屬信息的前50個(gè)屬類(lèi)別進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分級(jí)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果。從圖5可以看出，2號(hào)樣的變形菌門(mén)（Proteobacteria）含量比1、3號(hào)樣少，其中的α、β、γ變形菌綱都是如此，但是2號(hào)樣的δ變形菌綱細(xì)菌豐度反而是最高的。黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）在1號(hào)樣中所占比列稍多，但是在黃單胞菌科下屬的寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）中1號(hào)樣大大超過(guò)其他2個(gè)樣本之和，而同是黃單胞菌科下屬的沙單胞菌（Arenimonas）則在1號(hào)樣中基本沒(méi)有，更為極端的是兩面神菌屬（Janibacter）和甲烷氧化菌甲基彎曲菌屬（Methylosinus）等菌屬基本上只在3號(hào)樣中存在。

3結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)不同比例牛糞和鋸末進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，采用宏基因組技術(shù)檢測(cè)堆肥后混合料的微生物組成。3個(gè)樣的種子發(fā)芽率都在50%以上，可見(jiàn)堆肥樣品基本完全腐熟，可直接作為肥料使用，各種基本性質(zhì)稍有差別。3個(gè)樣品的微生物種群都比較豐富，說(shuō)明微生物之間有良好的協(xié)同關(guān)系；在3個(gè)樣品中門(mén)水平含量最多的5個(gè)細(xì)菌門(mén)類(lèi)分別是變形桿菌、擬桿菌、壁菌門(mén)、螺旋菌門(mén)和放線菌門(mén)，其屬水平含量最多的是甲基單胞菌和固氮菌等營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化和合成的菌屬。降解纖維素的微生物隨著鋸末所占比例的減少而減少，1號(hào)樣中的營(yíng)養(yǎng)合成菌屬包括甲基單胞菌屬、噬氫菌屬、固氮菌屬和寡氧單胞菌，其含量均高于2、3號(hào)樣，說(shuō)明1號(hào)樣肥力更高，同時(shí)1號(hào)樣中噬纖維菌科比例較高，可見(jiàn)堆肥已經(jīng)充分腐熟。1號(hào)樣中的寡氧單胞菌比例較高，也印證了1號(hào)樣的CODcr和BOD5去除率較高。因此，牛糞與鋸末的比例為2 ∶1的堆肥效果要優(yōu)于3 ∶1、4 ∶1。

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