海南油茶優(yōu)樹選擇及DNA指紋圖譜構(gòu)建

陳偉文++鄭道君++楊立榮++云勇++陳加利++陳宣

摘要 通過初選、復(fù)選和精選，從海南島35個(gè)油茶居群中選出5株油茶優(yōu)樹，它們具有抗炭疽病強(qiáng)、產(chǎn)果量高、含油率高等特點(diǎn)，鮮果出籽率45.57%～52.00%，鮮果出油率7.30%～10.93%，單位冠幅產(chǎn)油0.11～0.21 kg/m2，產(chǎn)油量770.55～1 470.05 kg/hm2，茶油的酸值在0.21～0.30 mg/g之間，不飽和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亞油酸含量5.06%～6.32%。基于SRAP標(biāo)記，以引物組合Me1/Em4可把5個(gè)優(yōu)樹區(qū)分開，構(gòu)建了直觀、清晰、簡單的DNA指紋圖譜。

關(guān)鍵詞 油茶；優(yōu)樹；DNA指紋圖譜

中圖分類號 S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）07-0005-03

Selection and DNA Fingerprinting Construct of Camellia oleifera in Hainan

CHEN Wei-wen 1 ZHENG Dao-jun 2 YANG Li-rong 2 YUN Yong 2 CHEN Jia-li 2 CHEN Xuan 2 *

（1 Forest Seed and Seeding General Station of Hainan Province，Haikou Hainan 570203； 2 Institute of Tropical Horticulture，

Hainan Academy of Agricultural Sciences）

Abstract 5 plus trees from 35 populations were checked ultimately in Hainan，the results showed that these plus trees with the characters of anti-anthrax，high fruit and oil production.The plus trees′ fresh seed rate was 45.57%～52.00%，oil production rate was 7.30%～10.93%，oil production was 0.11～0.21 kg/m2 in crown units，oil production was 770.55～1 470.05 kg/hm2，and the oil acid value was 0.21～0.30 mg/g，the unsaturated fatty acids was 85.78%～89.10%，the linoleic acid content was 5.06%～6.32%.Based on SRAP markers，the primer composition Me1/Em4 could distinguish the 5 plus trees，construct clear and simple DNA fingerprintings.

Key words Camellia oleifera；plus trees；DNA fingerprinting

油茶（Camellia oleifera Abel.）與橄欖、油棕、椰子并稱世界四大木本油料植物，其茶油有豐富的營養(yǎng)成分和優(yōu)越的保健功能，有“食油之王”“東方橄欖油”等美譽(yù)，已被國際糧農(nóng)組織列為重點(diǎn)推廣的健康型食用油[1]。海南省具有發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)特色資源和氣候環(huán)境優(yōu)勢，油茶產(chǎn)業(yè)又是極富有開發(fā)前景的特色生態(tài)產(chǎn)業(yè)[2]，充分挖掘海南省油茶資源，選育新品種，可加快海南省農(nóng)林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，促進(jìn)農(nóng)民增收，對促進(jìn)海南省國際旅游島建設(shè)具有非常重要的意義。但是，由于海南油茶資源開發(fā)較晚，目前還沒有經(jīng)過審定的品種，單株產(chǎn)量低、良種少已成為當(dāng)前海南油茶發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸問題之一[3-5]。

目前，從現(xiàn)有林分中選擇優(yōu)良單株，是油茶新品種（無性系）培育的必經(jīng)步驟。從20世紀(jì)60年代起，我國油茶育種工作者相繼在全國各地選擇了林相較好的6 700 hm2油茶林進(jìn)行選優(yōu)，初選優(yōu)樹11 000多株。經(jīng)過復(fù)選和精選，最后決選出1 000多株優(yōu)樹。其中，廣西、江西、湖南、浙江等省（區(qū)）較多[6]，如安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)從1999年8月開始對安徽舒城縣境內(nèi)的油茶品種資源狀況做了一次較為全面的調(diào)查，并在現(xiàn)有資源中初選出2個(gè)優(yōu)良單株[7]。安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院針對安徽省祁門縣境內(nèi)原有的實(shí)生油茶林資源進(jìn)行考察研究，并篩選出一批優(yōu)株[8]。重慶市林業(yè)科學(xué)研究院等單位調(diào)查了重慶市36個(gè)油茶林分布，實(shí)測235株油茶單株，初步選出63株優(yōu)樹[9]。目前生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的無性系或品種，如湘林系列、亞林系列、贛系列、豐系列、長林系列、岑軟系列和桂無系列，均是在優(yōu)株基礎(chǔ)上培育而成。

為了較好地鑒定油茶新品種或無性系，國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)研究構(gòu)建了部分油茶新品種或無性系。如林萍等[10]采用SRAP標(biāo)記技術(shù)，對油茶長林系列進(jìn)行分析，建立了全部供試材料的DNA指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了12個(gè)無性系的有效鑒別；李阿池[11]通過建立和優(yōu)化AFLP體系，構(gòu)建了從福建省17個(gè)縣市50份參試材料的DNA指紋圖譜；張國武等[12]、溫 強(qiáng)等[13]采用ISSR分子標(biāo)記方法，建立了25個(gè)油茶無性系的DNA指紋庫。可見，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對油茶新品種（系）進(jìn)行研究可獲得可靠的結(jié)果。據(jù)此，本研究擬篩選出海南油茶優(yōu)樹并構(gòu)建DNA指紋圖譜，為海南油茶資源開發(fā)利用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 研究內(nèi)容與方法

1.1 調(diào)查范圍和時(shí)間

在查閱植物標(biāo)本和相關(guān)文獻(xiàn)資料基礎(chǔ)上，采用踏查法結(jié)合走訪當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶、農(nóng)林業(yè)部門、油茶加工點(diǎn)，尤其是油茶果實(shí)或茶油收購商，對海南島油茶資源分布情況進(jìn)行了全面的實(shí)地調(diào)查。同時(shí)，對各分布區(qū)15年以上油茶林林分現(xiàn)狀進(jìn)行了調(diào)查。項(xiàng)目組走訪調(diào)查了海南省?？?、定安、文昌、瓊海、澄邁、屯昌、瓊中、五指山和臨高9個(gè)市（縣）的38個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)（國營農(nóng)場），重點(diǎn)調(diào)查了分布區(qū)內(nèi)的35個(gè)油茶林（表1），這些鄉(xiāng)鎮(zhèn)基本涵蓋了海南省主要油茶分布區(qū)。調(diào)查時(shí)間從2013年9月至2015年11月，包括了3個(gè)油茶花果期。

1.2 優(yōu)選方法

通過實(shí)地調(diào)查，初步觀測油茶的樹形、果實(shí)分布、果實(shí)大小和花芽分布等情況，以及植株的病蟲害情況，并剖視果皮厚薄程度。初步估計(jì)樹冠掛果平均1.0 kg/m2以上，春梢枝數(shù)不少于掛果枝數(shù)，80%以上的春梢有花芽，而且花芽健壯、分布均勻者，即為初選優(yōu)株。在此基礎(chǔ)上，分株采集充分成熟的果實(shí)測定相關(guān)的性狀指標(biāo)，并在樹干上掛牌標(biāo)記優(yōu)樹編號。

1.3 優(yōu)樹選擇標(biāo)準(zhǔn)

油茶優(yōu)樹選擇標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《油茶第1部分：優(yōu)樹選擇和優(yōu)良無性系選育技術(shù)規(guī)程》（LY/T 1730.1—2008）進(jìn)行。海南油茶母株優(yōu)樹選擇的條件如下：

（1）樹形完整，樹冠開張，生長良好。

（2）無病或病害較輕，果實(shí)炭疽病率在3%以下。

（3）果實(shí)大小分布均勻，按冠幅乘積計(jì)算，2年平均單株鮮果產(chǎn)量為1 m2冠幅產(chǎn)茶果1.0 kg以上，小年產(chǎn)量不低于大年的50%；鮮果含油率7%以上；茶油酸價(jià)0.3以下。

（4）決選時(shí)，在上述條件相近的情況下，優(yōu)先選擇亞油酸含量高的單株（亞油酸的含量是選擇和判斷油茶品種品質(zhì)優(yōu)劣的重要評價(jià)指標(biāo)之一）。

1.4 茶油理化性質(zhì)

種仁含油率測定采用索氏抽取法，具體步驟參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《植物油料含油量測定》（GB/T 14488.1—2008）。油茶籽脂肪酸甲酯的制備按照GB/T 17376—2008標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，按照GB/T 17377—2008標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行氣相色譜分析。茶油酸值測定按《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》（GB/T 5009.37—2003）中酸值的測定方法進(jìn)行。

1.5 優(yōu)樹DNA指紋圖譜構(gòu)建

采用改良CTAB法提取油茶總DNA，PCR-SRAP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)體系參考林 萍等[10]方法，然后取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，EB染色后，在Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)中觀察、分析、記錄，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)1次。

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，采用人工讀帶的方法，在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，獲得每個(gè)引物的Excel 0-1矩陣。擴(kuò)增片段大小參照DNA ladder估測，擴(kuò)增片段編號由引物編號加片段大小組成。分別統(tǒng)計(jì)分析各優(yōu)樹的特異標(biāo)記、唯一缺失帶以及單一引物（組合）的特征譜帶。篩選出最佳引物（組合）后，根據(jù)0-1矩陣在Excel中繪制膠板圖的標(biāo)準(zhǔn)化圖，從而構(gòu)建油茶優(yōu)株的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南油茶優(yōu)樹初選結(jié)果

2013年10—12月之間，通過實(shí)地調(diào)查35個(gè)油茶居群（表1），實(shí)測243株油茶樹，結(jié)果表明，海南油茶種仁出油率較高，平均值為51.98%，海南不同油茶居群茶油的出油率變化不大，變異系數(shù)僅為4.21%；酸值、碘值和過氧化值在不同油茶居群間的變化則較大，平均酸值0.45 mg/g，變異系數(shù)達(dá)到38.6%；平均碘值102.99 g/100 g，變異系數(shù)為20.62%；平均過氧化值為3.39 mmol/kg，變異系數(shù)為27.92%。從中初選優(yōu)樹30株，這些初選優(yōu)樹的鮮果出籽率均達(dá)到38%以上，樹體生長良好，無病蟲害。

在2014年10—12月、2015年10—12月分別對上述初選優(yōu)樹進(jìn)行復(fù)選和精選，最終確定5株優(yōu)樹。5株優(yōu)樹的形態(tài)與經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)分別見表2和表3。

2013—2015連續(xù)3年的觀測結(jié)果表明，所選優(yōu)樹的花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果實(shí)成熟期10月中上旬至11月上旬，具有抗炭疽病強(qiáng)、產(chǎn)果量高、含油率高等特點(diǎn)。單鮮果重26.66～76.69 g，鮮果出籽率45.57%～52.00%，鮮果出油率7.30%～10.93%，單位冠幅產(chǎn)油0.11～0.21 kg/m2，產(chǎn)油量770.55～1 470.05 kg/hm2，連續(xù)3年觀測平均值見表4。茶油酸值在0.21～0.30 mg/g之間，不飽和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亞油酸含量在5.06%～6.32%之間（表5），相關(guān)特性指標(biāo)表現(xiàn)優(yōu)異。

2.2 優(yōu)樹指紋圖譜

基于SRAP標(biāo)記，以引物組合Me1/Em4可把5個(gè)優(yōu)樹區(qū)分開，構(gòu)建了直觀、清晰、簡單的DNA指紋圖譜。其中瓊優(yōu)1在1 200 bp處有特異帶，瓊優(yōu)2在1 800 bp和850 bp處有特異帶，瓊優(yōu)3在500 bp和180 bp處有特異帶，瓊優(yōu)4在950 bp處有唯一缺失帶，瓊優(yōu)6在1 500 bp和350 bp處有特異帶，均可作為唯一特異性鑒別條帶。

3 結(jié)論

3.1 篩選獲得優(yōu)樹5株

本研究最終確定5株優(yōu)樹，特征為花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果實(shí)成熟期10月中上旬至11月上旬，平均單鮮果重42.33 g，平均鮮果出籽率為48.04%，鮮果平均出油率為8.59%，單位冠幅平均產(chǎn)油量為0.14 kg/m2，最高可達(dá)0.21 kg/m2，平均產(chǎn)油量為952.48 kg/hm2，最高可達(dá)1 470.05 kg/hm2，茶油平均酸值在0.24 mg/g，不飽和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亞油酸含量在5.06%～6.32%之間，平均為5.69%，相關(guān)特性指標(biāo)綜合表現(xiàn)優(yōu)異。

3.2 構(gòu)建優(yōu)樹的DNA指紋圖譜

基于SRAP標(biāo)記，以引物組合Me1/Em4可把5個(gè)優(yōu)樹區(qū)分開，構(gòu)建了直觀、清晰、簡單的DNA指紋圖譜。

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