古尼蟲草菌絲體多糖降解及體外抗氧化活性研究

朱振元，董海燕，王騰月

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

古尼蟲草菌絲體多糖降解及體外抗氧化活性研究

朱振元，董海燕，王騰月

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

研究了古尼蟲草菌絲體多糖的提取、降解及其抗氧化活性。分別用氧化降解法、酶解法和超聲降解法處理古尼蟲草菌絲多糖，分析測定菌絲多糖及3種不同降解產(chǎn)物清除1，2－二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）、超氧陰離子（）、羥自由基（·OH）的能力，結果表明該多糖清除DPPH·、·OH能力良好。超聲降解法對原糖清除DPPH·、·OH能力損失最小，且對清除DPPH·有促進作用。

古尼蟲草；多糖；降解；抗氧化活性

古尼蟲草[Cordyceps Gunnii（Berk.）BerK.]為麥角科（Clavicipiraceae）蟲草屬（Cordyceps）真菌。研究表明，蟲草具有十分廣泛的生理作用，包括抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗菌，調節(jié)免疫、降血糖、保肝護腎、影響系統(tǒng)性紅斑狼瘡及DNA酶活性[1]，治療錐蟲病[2]、風濕病[3]，白血病[4]、調節(jié)呼吸系統(tǒng)[5]、抗氧化[6－8]等。

蟲草多糖是古尼蟲草的重要藥理成分。多糖構效關系的研究表明，多糖分子大小與其抗腫瘤活性、抗血栓活性的作用之間有顯著的相關性。而且只有在一定的分子量范圍內才有較高的活性。由于未降解的多糖分子量大、分子體積大、水溶性差，不利于生物吸收人體內發(fā)揮生物活性，而且若直接注人體內也有較大毒性，極大的限制了多糖的應用[9]。有關研究顯示通過化學法或物理法對多糖降解，所獲的一些寡糖片斷仍具有生物活性，甚至生物活性明顯增強[10]。降解分子量過大的多糖，增強其生物活性，是一種有效的方法，這為多糖類生物制品研發(fā)開辟了一條新途徑。同時，多糖“活性片段”的研究，不僅有利于研究復雜的多糖結構及揭示結構和功能的關系，而且對多糖生物制品的藥代動力學、作用機制和質量控制標準都起到重要促進作用，并在化學合成方面也有積極的借鑒作用。因此，研究多糖的降解具有十分重要的意義。目前多糖降解主要有化學降解、物理降解和酶降解法。3種降解方法各有優(yōu)缺點，本文旨在尋找一種適合古尼蟲草菌絲多糖降解的降解方法在力求不損傷古尼蟲草菌絲多糖生物活性的前提下降低其分子量，以擴展古尼蟲草菌絲多糖的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

古尼蟲草[Cordyceps gunnii（Berk.）Berk.]菌絲粉：由天津科技大學生物資源與功能食品研究室提供。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇（分析純）、氯仿、乙酸乙酯：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；正丁醇、丙三醇：天津化學試劑有限公司；苯酚：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；硫酸、過硫酸銨、鹽酸（優(yōu)級純）：天津市化學試劑三廠；丙烯酰胺、N，N－甲叉雙丙烯酰胺、β－巰基乙醇、TEMED、DPPH·：Sigma Co.Ltd；溴酚藍指示劑、冰乙酸：天津市凱通化學試劑有限公司；甘氨酸：Amresco；過氧化氫（化學純）：天津市天大化工實驗廠；水楊酸、硫酸亞鐵：天津市化學試劑四廠；十二烷基硫酸鈉：天津市天新精細化工開發(fā)中心；甲醇：天津市四通化工廠；高溫淀粉酶（20 000 U/mL）：天津諾奧科技發(fā)展有限公司；鄰苯三酚：貴州遵義佳宏化工有限責任公司；SephadexG－75：鼎國生物。

TGL－16C臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE－52A旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DZF6020型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；SP－2120型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SHB88循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；LG J－0.5型臺式冷凍干燥機：軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠；酶標儀：Thermo Electron U.S.A旋；NDJ－1型轉粘度計：上海精密科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取純化及測定

1）多糖提取純化流程：抽提→濃縮→乙醇靜置→離心→洗滌→沉淀→干燥→蟲草多糖。

2）將凍干后的粉末狀多糖收集于棕色小藥瓶中，命名為MPCG－50。

3）用苯酚－硫酸法分別測定上述兩樣品的多糖含量。

1.3.2 多糖降解產(chǎn)物的制備

1.3.2.1 氧化降解法

取質量分數(shù)為30%H2O2溶液2 mL于小燒杯中，加入0.4 g多糖MPCG－50，加蒸餾水定容至20 mL，在38℃條件下水浴反應3 h。反應結束后旋蒸濃縮后凍干得多糖降解產(chǎn)物。

1.3.2.2 酶解法

將20 000 U/mL的高溫淀粉酶稀釋至2 U/mL，取2mL于小燒杯中，將0.1 g多糖MPCG－50溶解在18 mL蒸餾水中，倒入小燒杯中，混合均勻在90℃條件下水浴反應40 min。反應結束后旋蒸濃縮后凍干得多糖降解產(chǎn)物。

1.3.2.3 超聲降解法

將0.1 g多糖MPCG－50在小燒杯中溶解于50 mL蒸餾水中，制成糖液，放在超聲清洗機中，功率設為49%，25℃條件下反應4 min。反應結束后旋蒸濃縮后凍干得多糖降解產(chǎn)物[11]。

1.3.3 多糖降解結果分析

1.3.3.1 多糖黏度的測定

準確稱取不同組分多糖0.010 g，配制成50 mL溶液，即濃度為0.2 mg/mL，室溫下用旋轉黏度計測定其黏度。

1.3.3.2 多糖降解產(chǎn)物Sephadex G－75凝膠色譜柱分析

將溶脹、脫氣、平衡處理后的凝膠裝柱，以三蒸水作為洗脫液平衡3個～5個柱床體積，將0.1 g粗多糖溶液溶解在2 mL蒸餾水中，配制成50 mg/mL的多糖液，并上樣，三蒸水洗脫，每管收集2 mL，直至將多糖全部洗脫下來。苯酚硫酸法測定各管中多糖濃度，以試管編號為橫坐標，吸光度值為縱坐標做洗脫曲線，將各個峰的試管分別合并，冷凍干燥，得不同組分蟲草多糖。

1.3.4 多糖降解產(chǎn)物抗氧化活性的研究

1.3.4.1 清除超氧陰離子

采用鄰苯三酚法[12]。鄰苯三酚在堿性的溶液中易發(fā)生氧化反應，生成有色中間物質和超氧陰離子，隨著時間的進行，有色產(chǎn)物得到積累，同時超氧陰離子清除劑能減小反應體系在320 nm處的吸光度。取2.25 mL Tris－HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.2），于25℃下預熱20 min，加入0.5 mL不同濃度的古尼蟲草菌絲體多糖溶液和0.2 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，迅速混勻后于25℃下反應，反應30 s后，于320 nm波長處測定溶液的吸光度。

1.3.4.2 清除羥自由基

本試驗以Smironff[13]等的方法為基礎加以改進。

在1.5 mL的離心管中分別加入6 mmol/L的FeSO4溶于100 μL，6 mmol/L的H2O2溶液100 μL，不同濃度的樣品溶液100 μL，搖勻靜置10 min后，分別向其中加入6 mmol/L的水楊酸溶液100 μL，搖勻靜置30 min后用酶標儀于510 nm下測定各自的吸光度值Ai；扣底物組以蒸餾水代替底物水楊酸測得Aj；對照組以蒸餾水代替樣品測A0。

1.3.4.3 清除1，2－二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）[14－15]

在200 μL的5 μmol/L的DPPH·無水乙醇溶液中加入70 μL不同濃度的樣品溶液，封閉，反應60 min后在517 nm波長下測吸光度Ai；以200 μL的無水乙醇與70 μL蒸餾水的混合液為空白，測其吸光度值為A0；Aj為底物吸光度值：

式中：Ai為加樣反應后反應液的吸光度；Aj為以乙醇代替DPPH·反應后的吸光度（扣除底物）；A0為以三蒸水代替樣品的空白吸光度。

2 結果與分析

2.1 多糖及其降解產(chǎn)物制備與分析

2.1.1 多糖降解前的的分離純化及分析

2.1.1.1 繪制葡萄糖標準曲線

以無水葡萄糖為標樣繪制標準曲線。采用苯酚－硫酸法。用100 μg/mL標準葡萄糖作標樣，蒸餾水作空白對照。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curvilinear of glucose

回歸方程為y=0.012 74x+0.011 58，R2=0.999 05，標準葡萄糖含量在20 μg～100 μg之間成良好的線性關系。

2.1.1.2 多糖制備

通過對100 g古尼蟲草菌絲粉進行蒸餾水兩次過夜浸提、去蛋白、去脂、50%和70%乙醇終濃度沉淀、冷凍干燥若干步操作后，得到淺褐色多糖MPCG－50 11.714 1 g，經(jīng)全波長掃描，在280 nm處無蛋白吸收峰。根據(jù)葡萄糖標準曲線（圖1）測得MPCG－50的糖含量分別為69.24%。

2.1.2 多糖降解產(chǎn)物的制備

2.1.2.1 氧化降解法

H2O2濃度為30 mg/mL，多糖濃度為30 mg/mL，在38℃條件下水浴反應3 h。1.2 g多糖降解后旋蒸濃縮，凍干得到多糖降解產(chǎn)物1.141 6 g，得率如表1所示。

2.1.2.2 酶解法

多糖溶液濃度為0.005 g/mL，加酶量為40 U/g，在90℃條件下水浴反應40 min，0.3 g多糖降解后旋蒸濃縮，凍干得到多糖降解產(chǎn)物0.201 0 g，得率如表1所示。

2.1.2.3 超聲降解法

① 生活往往喜歡與我們開玩笑，甜美的果實有亂人心神的毒性，平坦的大道上從不缺少美麗的陷阱。② 一旦我們雙眼被假象蒙蔽，沉醉在外界濫加的動聽的修飾語中不可自拔，我們便會毫無例外地走向沉淪，不管你曾經(jīng)有多大能耐。③ 縱橫天下的西楚霸王，沒幾年便落得烏江自刎；自詡為上邦天國的清王朝，在一片鴉片的云霧中被人轟開大門。④ 更何況我們大多是普通人，更加難以承受生活的重壓，沒有幾個回合便會敗下陣來。⑤ 因此，始終保持謹慎是幸福人生的重要保證。⑥ 逆境中不氣餒，順境中不驕傲，還生活一個本來面目。

多糖溶液濃度為0.01 g/mL，超聲功率設為49%，25℃條件下反應4 min，0.3 g多糖降解后旋蒸濃縮，凍干得到多糖降解產(chǎn)物0.234 9 g，得率如表1所示。

表1 不同降解方法得率Table 1 Yield of different degradation

2.1.3 多糖降解結果分析

2.1.3.1 多糖黏度的測定

黏度測定結果如表2所示。

表2 多糖的黏度Table 2 Viscosity of polysaccharide

由表2可知，與原糖相比，3種降解產(chǎn)物的黏度均有所降低，反映出3種降解產(chǎn)物的分子量有所降低，降解基本成功。

2.1.3.2 粗多糖降解產(chǎn)物的Sephadex G－75凝膠色譜柱分析

由圖2可知，可以看出3種粗多糖降解產(chǎn)物的洗脫曲線出峰時間比原糖的出峰時間向后推遲。根據(jù)Sephadex G－75柱層析的原理，我們可以得知原多糖經(jīng)過降解后分子量有所降低，降解基本成功。

圖2 多糖Sephadex G-75柱層析洗脫曲線Fig.2 The elusion carve of polysaccharide by Sephadex G-75

2.2 多糖降解產(chǎn)物抗氧化活性的研究

2.2.1 清除羥自由基

羥自由基的化學性質極為活潑，也是毒性最大的自由基，可以與多種有機物或無機物反應，試驗結果如圖3所示。

圖3 MPCG-50降解前后對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging ability of Cordyceps gunnii polysaccharide and its degraded products on·OH

由圖3可知，古尼蟲草多糖MPCG-50及其降解產(chǎn)物對羥自由的清除能力都較強，而且還均呈現(xiàn)出隨濃度的增加而增大，達到一定濃度以后清除能力達到平衡的趨勢。通過與VC進行比較，當其濃度為2 mg/mL時，清除率均在80%上下，到達6 mg/mL時，清除率均接近了100%，大于6 mg/mL后基本趨于平衡，說明大分子的MPCG-50及其較小分子的降解產(chǎn)物已經(jīng)表現(xiàn)出很好的清除羥自由基能力，四者差別不大。

2.2.2 清除超氧陰離子

超氧陰離子是所有氧自由基中的第一個自由基，可以經(jīng)過一系列反應生成其他氧自由基，與許多疾病有密切的聯(lián)系，因此測定多糖對超氧陰離子自由基的清除作用具有重要的意義。試驗結果如圖4所示。

由圖4所示，古尼蟲草多糖MPCG-50及其降解產(chǎn)物對超氧陰離子的清除能力均呈現(xiàn)出隨濃度的增加而減小的趨勢。通過與VC進行比較，MPCG-50及其降解產(chǎn)物清除超氧陰離子自由基能力較弱，MPCG-50及其3種不同方法得到的降解產(chǎn)物相比較差別較大，用氧化和超聲降解方法得到的降解產(chǎn)物幾乎表現(xiàn)不出對超氧陰離子自由基的清除能力，酶解法獲得的降解產(chǎn)物的清楚能力相對MPCG-50原糖稍強。

圖4 MPCG-50降解前后對的清除作用Fig.4 Scavenging ability of Cordyceps gunnii polysaccharide and its degraded products on

2.2.3 清除1，2-二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）

大多數(shù)自由基化學性質極為活潑，壽命極短。然而也有少數(shù)的自由基如二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）的化學性質十分穩(wěn)定[16]。因此其常用來檢驗物質的抗氧化性。試驗結果如圖5所示。

圖5 MPCG-50降解前后對DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging ability of Cordyceps gunnii polysaccharide and its degraded products on DPPH·

由圖5所示，MPCG-50原糖、氧化降解法和超聲降解法獲得的降解產(chǎn)物對DPPH·的清除能力在一定濃度范圍內隨著多糖濃度的增加而增大，達到一定濃度以后清除能力開始下降。其中酶解法和氧化法所得降解產(chǎn)物清除DPPH·的能力在大于8 mg/mL的高濃度區(qū)域內又有所回升，但其清除能力均小于原糖。綜合來看，超聲降解產(chǎn)物對DPPH·的清除活性比原糖要高；當MPCG-50原糖濃度為8 mg/mL時，清除率達到了69.3%，大于8 mg/mL后開始下降；當超聲降解產(chǎn)物濃度到達10 mg/mL時，清除率達到了87.5%，大于10 mg/mL后開始有所下降。

3 結論

比較MPCG-50原糖及其用3種不同方法獲得的降解產(chǎn)物清除DPPH·、O2-·、·OH的能力，可以看出該多糖具有很好的抗氧化效果，清除DPPH·、·OH能力顯著。對DPPH·的清除能力方面，超聲降解法所得降解產(chǎn)物的清除效果最為顯著，與原糖相比有所提高。由于超聲降解多糖產(chǎn)物與MPCG-50原糖及其他方法降解產(chǎn)物相比黏度明顯降低，可認為該產(chǎn)物分子量與其他降解產(chǎn)物相比較小。因此，采用超聲法降解古尼蟲草菌絲多糖效果比較理想，既能達到降低MPCG-50原糖分子量的目的，又可以最大程度的保持原糖的抗氧化活性。

[1] R Russell M Paterson.Cordyceps-a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory[J].Phytochemistry,2008,69 (7):1469-1495

[2] Vodnala S K,Ferella M,Lunden-Miguel H,et al.Preclinical assessment of thetreatment of second-stage African trypanosomiasis with cordycepin and deoxycoformycin[J].PLoS NeglectedTropical Diseases,2009,3(8):e495

[3] Noh E M,Kim J S,Hur H,et al.Cordycepin inhibits IL-1β-induced MMP-1 and MMP-3expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J].Rheumatology,2009,48:45-48

[4] 康冀川,康超,文庭池,等.蟲草菌素藥理學研究進展[J].菌物學報, 2011,30(2):191-197

[5] Tuli H S,Sandhu S S,Sharma A K.Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to Cordycepin[J].3 Biotech,2014,4(1):1-12

[6] Zhu Z Y,Si C L,Zhong Y R.The purification and antioxidative activities inD-galactose-induced aging mice of a water-solublepolysaccharide from Cordyceps gunnii(berk.)Berk.mycelium[J].Journal of Food Biochemistry,2011,35(1):303-322

[7] Zhu Z Y,Yuan J,Li S F,et al.Preparation of sulfured polysaccharides from Cordyceps gunnii and itsanti-oxidation activity[J].Modern Food Science andTechnology,2011,27(1):1-5

[8] Zhu Z Y,Si C L,Zhang Y M.Purification and antioxidative activities of a water-soluble polysaccharide isolated from Cordyceps gunnii (berk.)Berk[J].mycelium Planta Medica,2009,75(9):PC15

[9] 陳蕾,吳皓.多糖降解方法的研究進展[J].中華中醫(yī)藥學刊,2008, 26(1):133-135

[10]肖建輝,梁宗琦,胡錫階,等.古尼蟲草多糖及其解聚物的免疫活性[J].免疫學雜志,2005,21(1):51-53,58

[11]劉梅,陳必鏈,陳偉平.超聲波降解紫球藻胞外多糖研究[J].亞熱帶植物科學,2008,37(l):48-50

[12]LI S P,SU Z R,DONG T T X,et al.The fruiting body and its host of Cordyceps sinensis show close resemblance in main constituents and anti-oxidation activity[J].Phytomedicine,2002(9):319-324

[13]Smirnoff N,Cumbes Q J.Hyroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J].Phytochemistry,1989,28(4):1057-1060

[14]成蘭英,梁書鳳,張治強.DPPH法研究麥冬提取物抗氧化活性[J].精細化工,2012,29(9):870-874

[15]Joan H Y,Hsiu C L,Jeng L M.Antioxidant properties of several commercial mushrooms[J].Food Chemistry,2002,77:229-235

[16]韋獻雅,殷麗琴,鐘成,等.DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J].食品科學,2014,35(9):317-322

Degradation of Cordyceps gunnii Polysaccharide and Antioxidation of Its Degraded Products

ZHU Zhen－yuan，DONG Hai－yan，WANG Teng－yue
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Science and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The polysaccharide from Cordyceps gunnii mycelia was separated and purified，and the preparation and antioxidant activity of its degraded products were discussed.Polysaccharides from Cordyceps gunnii mycelia prolifera were prepared in our laboratory and degraded with three different ways.The polysaccharides from Cordyceps gunnii mycelia prolifera was named MPCG－50.The ability of removing DPPH·，，·OH of MPCG－50 and degraded products which were obtained by three different methods was determined.The results showed that the polysaccharide had a good antioxidant ability.But the ability of removing DPPH·，was changed compared with MPCG－50.The degraded products of ultrasonic degradation changed a little and it′s positive.

Cordyceps gunnii；polysaccharide；degradation；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.001

2016-08-23

國家星火計劃重點項目（2015GA610001）；天津市自然科學基金重點項目（16JCZDJC34100）

朱振元（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：生物資源與功能食品。