裸項(xiàng)櫛鰕虎魚感染創(chuàng)傷弧菌初報(bào)

羅琴芳，黃文科，袁文，潘金春，黃韌，陳瑞愛,3,4*

(1. 廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東 云浮 527499；2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510260；3. 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東 肇慶 526238；4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

研究報(bào)告

裸項(xiàng)櫛鰕虎魚感染創(chuàng)傷弧菌初報(bào)

羅琴芳1，黃文科1，袁文2，潘金春2，黃韌2，陳瑞愛1,3,4*

(1. 廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東 云浮 527499；2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510260；3. 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東 肇慶 526238；4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

目的 分離及鑒定感染實(shí)驗(yàn)用鰕虎魚的病原菌。方法 將病料分離培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后，用16s rRNA及生理生化方法鑒定病原菌。結(jié)果 分離到了革蘭陰性弧菌，命名為：GDLAMI-1210株，顯微鏡下觀察為逗點(diǎn)樣形態(tài)，電鏡下可看到菌的一端鈍圓，一端長(zhǎng)桿彎曲的鞭毛，生理生化鑒定結(jié)果與弧菌一致，16s rRNA測(cè)序結(jié)果與創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27562T)等聚為一類菌，回歸實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌對(duì)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚有一定的致病性。結(jié)論 裸項(xiàng)櫛鰕虎魚感染創(chuàng)傷弧菌初報(bào)。

裸項(xiàng)櫛鰕虎魚；弧菌；致病性

由于魚類的流動(dòng)性，魚體中生理生化指標(biāo)的變化或魚體內(nèi)污染物含量的變化是魚體對(duì)游動(dòng)沿途海區(qū)污染狀況“空間勻和”后的結(jié)果，即反映沿途海區(qū)污染的平均狀況，因此，很多魚類(特別是游泳能力很強(qiáng)的魚類)可用作環(huán)境污染的指示生物。鰕虎魚為底棲穴居性魚類，個(gè)體小、易繁殖、分布廣，多數(shù)棲息在熱帶海水中，在海洋環(huán)境毒理學(xué)研究方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[1]。

裸項(xiàng)櫛鰕虎魚個(gè)體小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力強(qiáng)，便于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)管理，其存活率，生存狀態(tài)能夠直接反應(yīng)海水質(zhì)量，具有較高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開發(fā)價(jià)值。廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所聯(lián)合相關(guān)單位已逐步開展了裸項(xiàng)櫛鰕虎魚的人工飼養(yǎng)、生長(zhǎng)繁殖特性、胚胎、組織學(xué)特性等方面的研究[2-4]。就其毒理、病理學(xué)方面的研究，國內(nèi)外尚無報(bào)道。本文針對(duì)某試驗(yàn)中心裸項(xiàng)櫛鰕虎魚突然發(fā)病、死亡率近100%的突發(fā)事件，對(duì)其病魚進(jìn)行病原分析的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚25尾，尾重4～5 g，30～35日齡。由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所提供并飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予標(biāo)準(zhǔn)飼料(由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所提供)，12 h循環(huán)燈光，標(biāo)準(zhǔn)海水，飼養(yǎng)水溫為(28±0.5)℃。裸項(xiàng)櫛鰕虎魚飼養(yǎng)及組織取材均于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所實(shí)驗(yàn)設(shè)備內(nèi)【SYXK(粵)2012-0122】。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

各種培養(yǎng)基(5%綿羊血平板等)(北京陸橋，中國)，生化鑒定管(北京陸橋，中國)，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(廣州迪景微，中國)，16s rRNA PCR用聚合酶exTaq(TaKaRa，中國)，西班牙瓊脂糖購自(鼎國生物，中國)，2216改良培養(yǎng)基(由蛋白胨5 g、酵母提取物1 g、硫酸鐵0.1 g、15 g瓊脂、天然海水0.22 μm過濾1000 μL配制)，不同濃度NaCl溶液按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離、鑒定

病料來源于廣東省惠州市大亞灣地區(qū)淺水海域。直接將海水、病死裸項(xiàng)櫛鰕虎魚體表抹片革蘭染色鏡檢。將病死裸項(xiàng)櫛鰕虎魚無菌下剖檢，組織器官病料接種哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)；組織器官病料同時(shí)抹片染色鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌純化培養(yǎng)

將哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上單菌落接種在2216改良培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)菌生理生化特性檢測(cè)

按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.4 16s rRNA PCR

合成引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；P2：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。挑取單菌落溶入exTaq酶50 μL的PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及程序按exTaq酶說明書進(jìn)行(其中Tm為50℃)。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定有預(yù)期帶后，送交華大基因公司進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 用于16s rRNA基因序列分析的菌株Tab.1 Strains used for sequence analysis of the 16s rRNA

1.3 人工接種試驗(yàn)

將分離鑒定的菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、離心后，用滅菌的PBS按10倍比稀釋至107、106、105、104ffu/mL，按每尾50 μL的劑量腹腔接種裸項(xiàng)櫛鰕虎魚(試驗(yàn)前1 d 停止喂食，試驗(yàn)當(dāng)天不喂食，試驗(yàn)次日再開始喂食)。每天觀察魚臨床癥狀及死亡率，連續(xù)觀察7 d，對(duì)癥狀明顯的瀕死病魚進(jìn)行解剖和接種，對(duì)再分離菌株進(jìn)行上述同樣的分離鑒定、純化和人工感染。

2 結(jié)果與分析

為便于描述，分離菌命名為GDLAMI-1210株。

2.1GDLAMI-1210株的培養(yǎng)特性

在5%綿羊血平板中，菌落為α溶血、土褐色大菌落，革蘭染色呈紅色，短桿狀、逗點(diǎn)狀、錘狀菌。在2216改良培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)18 h，菌落呈土黃色大菌落。革蘭染色呈短桿狀、逗點(diǎn)狀菌(如圖1所示)。培養(yǎng)24 h的菌在電鏡下觀察，有較長(zhǎng)的單鞭毛(如圖2所示)。

圖1 分離菌革蘭染色結(jié)果Fig.1 Results of Gram staining of the isolated bacteria

2.2GDLAMI-1210株的生化鑒定結(jié)果

GDLAMI-1210株的生化鑒定結(jié)果顯示：生化項(xiàng)目的氧化酶、動(dòng)力、β-半乳糖苷、細(xì)胞色素氧化酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、1% NaCl蛋白胨水、3% NaCl蛋白胨水、5% NaCl蛋白胨水、8% NaCl蛋白胨水、甘露醇、肌醇均為陽性；生化項(xiàng)目的精氨酸雙水解酶、靛基質(zhì)、明膠、V-P試驗(yàn)、乳糖、蔗糖、纖維二糖均為陰性。2.3GDLAMI-1210株的16s rRNA PCR鑒定結(jié)果

GDLAMI-1210株與Olivares-Fuster等在2007年分離報(bào)道的創(chuàng)傷弧菌Vv34株的16s rRNA最為接近，與創(chuàng)傷弧菌ATCC27562T、C7184株16s rRNA聚為一群(如圖3所示)。

圖2 分離菌電鏡下特征Fig.2 Ultrastructural characteristics of the isolated bacteria

圖3 4株弧菌16s rRNA序列聚類Fig.3 Clustering analysis of the 16 S rRNA of the 4 strains

2.4GDLAMI-1210株人工接種試驗(yàn)結(jié)果

GDLAMI-1210株被人工接種裸項(xiàng)櫛鰕虎魚后，7 d內(nèi)裸項(xiàng)櫛鰕虎魚死亡情況為：感染組1(1×104稀釋)死亡數(shù)是5/5；感染組2(1×105稀釋)死亡數(shù)是4/5；感染組3(1×106稀釋)死亡數(shù)是1/5；感染組4(1×107稀釋)死亡數(shù)是1/5；空白對(duì)照組(PBS)死亡數(shù)是0/5。

3 討論

3.1 關(guān)于GDLAMI-1210株鑒定

本試驗(yàn)從人工養(yǎng)殖的裸項(xiàng)櫛蝦虎魚腦、尾分離出一株革蘭陰性菌(GDLAMI-1210)，通過人工接種試驗(yàn)證實(shí)其為該病的病原菌。根據(jù)該菌的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性初步確定為弧菌，但其生理生化特性與文獻(xiàn)報(bào)道的諸多弧菌菌株的生理生化特性存在一定的差異[6]，而不能進(jìn)行確切的鑒定。16s rRNA是核糖體RNA的一種，其分子在結(jié)構(gòu)上的保守區(qū)能反映生物物種的親緣關(guān)系，可變區(qū)具有能揭示生物物種的特征核酸序列等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最適細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)，被稱為是細(xì)菌的“分子化石”，目前已廣泛用于病原菌的鑒定[7]。因此，根據(jù)弧菌16s rRNA特征[5]，采用一對(duì)16s rRNA通用引物，從細(xì)菌基因組擴(kuò)增出約1.5 kb的DNA片段，將獲得的片段送交華大基因公司測(cè)序，序列經(jīng)Blast分析，與創(chuàng)傷弧菌株V.vulnificusVv34的16s rRNA序列(GenBank收錄號(hào)EF546291)最為接近，與創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27562T等聚為一類，從分子生物學(xué)鑒定方法進(jìn)一步推斷，GDLAMI-1210株疑為創(chuàng)傷弧菌株。

3.2 裸項(xiàng)櫛蝦虎魚人工感染GDLAMI-1210株的臨床癥狀

弧菌廣泛分布于近海及河口的海洋環(huán)境，已經(jīng)證明有許多種弧菌是魚類的重要條件性致病菌。其中尤以霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌、擬態(tài)弧菌、費(fèi)氏弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌等最為重要?；【∈鞘澜绺鲊a(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中普遍流行、危害最大的細(xì)菌性疾病之一。其中創(chuàng)傷弧菌有2個(gè)生物型，分別為生物I型和生物II型。生物I型主要是人類的致病菌，也能感染養(yǎng)殖魚類，澳大利亞養(yǎng)殖的尖吻鱸發(fā)生過由創(chuàng)傷弧菌生物I型引起的弧菌病，死亡率高達(dá)80%。刨傷弧菌生物II型是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的致病菌，也是人類的條件致病菌，感染魚發(fā)病癥狀相似，均表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩，經(jīng)常游出水面，發(fā)病初期鰭末端充血、發(fā)炎；魚體兩側(cè)有出血點(diǎn)；腹部、肛門紅腫、出血；肝臟表面有出血點(diǎn)，腫大，顏色淡；腎臟水腫發(fā)黑有淤血現(xiàn)象；腸有炎癥和積水，積水呈黃綠色；病魚沉底死亡。本次人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：分離菌株GDLAMI-1210人工感染裸項(xiàng)櫛鰕虎魚后較短時(shí)間內(nèi)翻身游動(dòng)，身體失去平衡，魚鰓、魚尾充血，隨之死亡，死亡魚身體變黑、腎臟腫大糜爛。這些癥狀與馬愛敏[5]、王志剛[8]、Matsumoto 等[9]報(bào)道的感染弧菌結(jié)果有部分相似之處，由此可推斷，所分離的菌株GDLAMI-1210為一種創(chuàng)傷弧菌。

3.3 裸項(xiàng)櫛鰕虎魚的微生物質(zhì)量控制

裸項(xiàng)櫛鰕虎魚是一種具有較高應(yīng)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)魚類。分離培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌和回歸實(shí)驗(yàn)，對(duì)于裸項(xiàng)櫛鰕虎魚標(biāo)準(zhǔn)化研究，特別是裸項(xiàng)櫛鰕虎魚的微生物質(zhì)量控制具有重要的意義。海水中微生物的存在及裸項(xiàng)櫛虎魚對(duì)海水微生物的敏感性試驗(yàn)尚待開展。本試驗(yàn)是裸項(xiàng)櫛鰕虎魚感染創(chuàng)傷弧菌的首次報(bào)道，該菌的生物學(xué)特性(具體的分類鑒定)、致病性，裸項(xiàng)櫛鰕虎魚感染該菌的條件、病理變化特征，以及藥物治療或預(yù)防等方面的實(shí)驗(yàn)工作有待進(jìn)一步的研究和報(bào)道。

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A report ofVibriosp.GDLAMI-1210, isolated fromCtenogobiusgymnauchencultured in seawater

LUO Qin-fang1, HUANG Wen-ke1, YUAN Wen2, PAN Jin-chun2, HUANG Ren2,CHEN Rui-ai1,3,4*

(1. Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co., LTD., Yunfu Guangdong 527499, China; 2. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510260; 3. Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co., LTD, Zhaoqing Guangdong 526238; 4. College of Veterinary, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

Objective To observe and identify the microorganism isolated from diseased and deadCtenogobiusgymnauchencultured in seawater near the Daya Bay of south China sea. MethodsGDLAMI-1210 strain was isolated from the diseasedCtenogobiusgymnauchen(Bleeker). We applied physiological and biochemical characteristics in the bacterial classification. In order to confirm the results, we amplified a 1438 bp sequence ofGDLAMI-1210’s 16 S rRNA(HM 362434)and compared with other sequence in GenBank, and followed by artificial infection. Results The GDLAMI-1210 strain was Gram-negative and in a shape of short rod with single polar flagellum. The homology analysis and phylogenetic study showed that the 16 S rRNA sequence ofGDLAMI-1210 has the highest similarity toVibriosp.especVibriovulnificus, showing 99% identity. Conclusions To our knowledge, this is the first report that the causative pathogen,Vibriosp, leads to the mortality ofCtenogobiusgymnauchen(Bleeker).

Ctenogobiusgymnauchen(Bleeker);Vibriosp; Pathogen

CHEN Rui-ai，E-mail: chensa@163.com

羅琴芳(1970-)，女，博士，研究方向：禽病及生藥創(chuàng)制研究。E-mail: luoqinffer@hotmail.com。黃文科(1980-)，男，碩士，研究方向：禽病及生藥創(chuàng)制研究。E-mail: 22932662@qq.com。共同第一作者

陳瑞愛(1970-)，女，教授，研究方向：動(dòng)物疫病防控及生藥創(chuàng)制研究。E-mail: chensa@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0225-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.020

2016-09-19