超聲波處理對(duì)纖維素酶法水解竹粉的影響

杜曉瑩， 傅佳佳,2， 王鴻博， 高衛(wèi)東, 蔣春燕

(1. 江南大學(xué) 江蘇省功能紡織品工程技術(shù)研究中心， 江蘇 無(wú)錫 214122； 2. 蘇州大學(xué) 絲綢工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123； 3. 圣華盾防護(hù)科技股份有限公司， 江蘇 江陰 214413)

超聲波處理對(duì)纖維素酶法水解竹粉的影響

杜曉瑩1， 傅佳佳1,2， 王鴻博1， 高衛(wèi)東1, 蔣春燕3

(1. 江南大學(xué) 江蘇省功能紡織品工程技術(shù)研究中心， 江蘇 無(wú)錫 214122； 2. 蘇州大學(xué) 絲綢工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123； 3. 圣華盾防護(hù)科技股份有限公司， 江蘇 江陰 214413)

針對(duì)采用生物酶法對(duì)竹材脫膠時(shí)竹材復(fù)雜致密的結(jié)構(gòu)阻礙酶的作用的問(wèn)題，在酶解前采用超聲波對(duì)竹材進(jìn)行預(yù)處理。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定合適的超聲波預(yù)處理?xiàng)l件為：頻率20 kHz，功率960 W，時(shí)間15 min，浴比1∶30，室溫。相同酶解條件下使用纖維素酶分別水解超聲波處理竹粉和原竹粉，反應(yīng)12 h時(shí)前者較后者生成的還原糖量提高了34.48%；通過(guò)掃描電子顯微鏡、紅外光譜和X射線衍射儀觀察超聲波預(yù)處理前后竹材表面、化學(xué)結(jié)構(gòu)及結(jié)晶度變化。結(jié)果表明：經(jīng)超聲波處理竹材表面結(jié)構(gòu)被破壞，空隙和孔洞數(shù)量增加，有效接觸面積增加，結(jié)晶度降低了11.68%，但化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化；超聲波是一種有效而溫和的預(yù)處理方式，不會(huì)改變竹材性質(zhì)。

超聲波； 纖維素酶； 竹粉； 還原糖； 結(jié)晶度

近年來(lái)，竹纖維因具有天然抗菌、防紫外線、環(huán)保等優(yōu)良特性而備受人們青睞[1]。按照不同的加工方法，目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的竹纖維[2]主要可分為3類(lèi)：竹原纖維、竹漿纖維和竹炭纖維。竹原纖維的制備方法有物理法、化學(xué)法、生物酶法。羅海等[3]采用蒸汽爆破有效地分離了竹纖維；王春紅等[4]采用化學(xué)方法處理爆破后的竹原纖維，制得了高拉伸強(qiáng)度(與玻璃纖維接近)和柔軟度的竹原纖維；鄧首哲等[5]采用生物酶法對(duì)竹纖維進(jìn)行脫膠，得出了半纖維素酶對(duì)竹纖維脫膠有一定效果的結(jié)論。

竹材主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，這3種物質(zhì)相互交聯(lián)、纏結(jié)，構(gòu)成了竹材本身復(fù)雜而致密的結(jié)構(gòu)。研究表明，纖維素是竹中對(duì)酶而言最可及的物質(zhì)[6]，且在天然的漚竹體系中測(cè)得纖維素酶活存在，因此，選用纖維素酶水解竹材，以期打開(kāi)竹材的致密結(jié)構(gòu)，為后續(xù)脫膠酶的滲透提供有效通道。竹材復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及結(jié)晶區(qū)的存在影響了水解效率。為提高水解效率，在纖維素酶水解竹粉前需采用預(yù)處理方式處理竹材，以改變竹材表面可及度及結(jié)晶度。竹粉常見(jiàn)的預(yù)處理方式有高溫高壓法、微波法和超聲波法。高溫高壓法需要較大的外界能量，采用微波法作用時(shí)產(chǎn)生的溫度會(huì)對(duì)纖維造成損傷，因此本文采用超聲波法作為預(yù)處理方式處理竹粉。

超聲波是一種高效、環(huán)保的新型能量形式，目前已有研究者將超聲波與生物酶聯(lián)合使用處理秸稈、蔗渣等生態(tài)廢棄物以制備新型燃料生態(tài)乙醇[7-8]。超聲波處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)[9]。本文主要利用超聲波在液體介質(zhì)中的空化效應(yīng)預(yù)處理竹粉，以改變竹粉結(jié)構(gòu)，提高酶解效率，從而為生物酶高效水解木質(zhì)纖維素纖維提供一種有效途徑。

1 試驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

原料：過(guò)60目篩的1年生毛竹粉末，用甲苯和乙醇按體積比2∶1混合對(duì)竹粉進(jìn)行抽提[10]，抽提后竹粉作為試驗(yàn)用原竹粉。

主要試劑：中性纖維素酶8000L，購(gòu)于上海諾維信(Novozymes)公司；羧甲基纖維素(CMC)，3，5-二硝基水楊酸(DNS)，考馬斯亮藍(lán)G-250，牛血清白蛋白(BAS)，購(gòu)于百靈威科技有限公司。

1.2 主要儀器

儀器：FS-1200超聲波處理器(上海生析超聲儀器有限公司)；UV-9600紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器有限公司)；SU1510掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；NICOLET IS 10紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；X射線衍射儀(德國(guó)布魯克AXS有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素酶比酶活的測(cè)定

采用DNS法[10]確定最適條件下纖維素酶酶活。酶活定義：每分鐘CMC產(chǎn)生1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)單位(U)的酶活。采用Bradford法[11]測(cè)定纖維素酶的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算得到所用纖維素酶的比酶活。比酶活定義為每毫克蛋白的酶活力。

1.3.2 超聲波預(yù)處理

稱取0.2 g竹粉置于塑料離心管中，經(jīng)不同的超聲波條件處理，以相同纖維素酶酶解條件下還原糖的產(chǎn)量為指標(biāo)，確定適宜的超聲波處理?xiàng)l件。本文試驗(yàn)采用的超聲波儀器頻率為20 kHz，采用單因素分析法確定其他超聲波處理參數(shù)：功率為240～1 200 W，10%的增率變化，時(shí)間為10、20、30、40、50 min，浴比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。超聲波處理后的竹粉用去離子水清洗并在室溫條件下自然風(fēng)干。

1.3.3 纖維素酶水解

稱取0.05 g經(jīng)超聲波處理的竹粉于50 mL錐形瓶中，加入5 mL纖維素酶，用pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液定容至15 mL。對(duì)照樣中所加竹粉為未經(jīng)超聲波處理的原竹粉。每組樣品需要同時(shí)進(jìn)行2個(gè)平行試樣測(cè)試。將裝有以上反應(yīng)體系的錐形瓶放入50 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中，分別在反應(yīng)0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)用移液器取0.3 mL的反應(yīng)液于0.5 mL離心管中，離心機(jī)離心后，置于-4 ℃冰箱待用。

1.3.4 還原糖產(chǎn)量測(cè)定

所有樣品取樣完畢后，分別從每個(gè)離心管中取0.2 mL上清液于試管中，與DNS試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定還原糖含量[10]。用紫外分光光度計(jì)測(cè)520 nm處吸光度值，根據(jù)之前繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為還原糖量。

1.3.5 形貌觀察

分別對(duì)原竹粉及超聲波處理后竹粉表面噴金制樣，用掃描電鏡觀察竹粉表面結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.6 紅外光譜分析

分別將原竹粉與超聲波處理竹粉與溴化鉀粉末以1∶100的質(zhì)量比混合均勻并研磨壓片，使用紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.3.7 結(jié)晶度測(cè)試

采用X射線衍射儀掃描原竹粉和超聲波處理竹粉。測(cè)試條件為：40 kV管電壓、40 mA管電流、Ni濾波、Cu靶、Kα射線、掃描范圍在6°～40°之間，速度4(°)/min，采用Jade軟件[12]對(duì)圖譜進(jìn)行分峰、擬合并計(jì)算超聲波處理前后竹粉的結(jié)晶度。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶性質(zhì)

本文試驗(yàn)中所用纖維素酶為中性纖維素酶，最適反應(yīng)條件為pH值7.0，50 ℃。在此條件下測(cè)得1 mL酶液的酶活為3.12 U，對(duì)應(yīng)的蛋白含量為1.52 mg，經(jīng)計(jì)算得此酶的比酶活為2.05 U/mg。

2.2 超聲波預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 功 率

超聲波處理?xiàng)l件為：頻率20 kHz，時(shí)間30 min，浴比1∶20，室溫。超聲波功率對(duì)還原糖產(chǎn)量(反應(yīng)12 h)的影響如圖1所示?？梢钥闯觯S超聲波功率的增加，還原糖生成量的總體趨勢(shì)是先增后減。低功率超聲波處理(240、360、480 W)竹粉時(shí)，還原糖產(chǎn)量甚至低于原竹粉。這是因?yàn)槌暡ㄌ幚頃?huì)先破壞竹粉的無(wú)定形區(qū)，結(jié)晶區(qū)比例增加，酶液較難進(jìn)入竹粉內(nèi)部，纖維素酶水解產(chǎn)生的還原糖量也隨之減少。隨著超聲波功率的增加(600、720、840、960 W)，竹粉的結(jié)晶區(qū)也被超聲波產(chǎn)生的較大剪切力破壞，纖維素酶進(jìn)入竹粉內(nèi)部，還原糖產(chǎn)量增加，但超聲波功率繼續(xù)增加(1 080、1 200 W)，還原糖產(chǎn)量反而下降。這是因?yàn)槌暡栈?yīng)產(chǎn)生的巨大的高溫高壓會(huì)直接破壞竹粉的多糖物質(zhì)，即便纖維素酶進(jìn)入竹粉內(nèi)部，也無(wú)更多的多糖物質(zhì)可分解為還原糖。結(jié)合圖1可以得出，最優(yōu)超聲波處理功率為960 W。

圖1 超聲波處理功率對(duì)還原糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Influence of ultrasonic power on reducing sugar yield

2.2.2 時(shí) 間

超聲波處理?xiàng)l件為：頻率20 kHz，功率960 W，浴比1∶20，室溫。超聲波處理浴比對(duì)還原糖產(chǎn)量(反應(yīng)12 h)的影響如圖2所示?？梢钥闯?，還原糖產(chǎn)量隨超聲波處理時(shí)間的變化與隨超聲波處理功率變化趨勢(shì)基本一致，隨著超聲作用時(shí)間的增加，生成的還原糖量先增加再減少。這是因?yàn)槌暡ㄌ幚砉β屎统暡ㄌ幚頃r(shí)間都和超聲波的空化強(qiáng)度有關(guān)。由圖2可知，超聲波處理15 min和20 min的還原糖產(chǎn)量相同，從節(jié)約能量、降低成本方面考慮，最優(yōu)超聲波處理時(shí)間為15 min。

圖2 超聲波處理時(shí)間對(duì)還原糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Influence of ultrasonic time on reducing sugar yield

2.2.3 浴 比

超聲波處理?xiàng)l件為：頻率20 kHz，功率960 W，時(shí)間15 min，室溫。超聲波處理浴比對(duì)還原糖產(chǎn)量(反應(yīng)12h)的影響如圖3所示。超聲波的空化效應(yīng)是在液體介質(zhì)中發(fā)生的，且超聲波探頭放入所處理樣品中的深度是一定的。當(dāng)竹粉的去離子水懸浮液中水的含量增加到一定程度時(shí)，超聲波探頭距離樣品容器底部的距離增加，超聲波所需傳播的距離增加，作用也就減弱。由圖3可知，最優(yōu)超聲波處理浴比為1∶30。

圖3 超聲波處理浴比對(duì)還原糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Influence of ultrasonic bath ratio on reducing sugar yield

2.3 超聲波預(yù)處理效果

超聲波預(yù)處理效果以纖維素酶水解竹粉生成的還原糖量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。超聲波預(yù)處理對(duì)纖維素酶水解竹粉產(chǎn)生還原糖量的影響如圖4所示?？梢钥闯?，在纖維素酶水解竹粉反應(yīng)進(jìn)行0～12 h的過(guò)程中，超聲波處理后竹粉生成的還原糖量均要高于原竹粉生成的還原糖量。經(jīng)計(jì)算，水解反應(yīng)12 h時(shí)超聲波處理竹粉生成的還原糖量較原竹粉提高了34.48%。2種竹粉的整體酶解趨勢(shì)大致相同：0～2 h時(shí)還原糖產(chǎn)量迅速增加，2～12 h時(shí)還原糖產(chǎn)量緩慢增加。由圖4可知，纖維素酶水解超聲波處理竹粉生成的還原糖量和反應(yīng)速率較原竹粉均有相應(yīng)的提高。這是因?yàn)橹穹蹚?fù)雜致密的結(jié)構(gòu)經(jīng)超聲波空化作用被破壞，竹粉擁有更多的酶附著位點(diǎn)，可以吸附更多的纖維素酶。

圖4 超聲波處理對(duì)還原糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Influence of ultrasonic pretreatment on reducing sugar yield

2.4 表面形態(tài)結(jié)構(gòu)

原竹粉和超聲波處理竹粉的掃描電鏡照片如圖5所示。由圖可見(jiàn)：原竹粉結(jié)構(gòu)排列整齊且表面較平滑，表面雜亂部分是由機(jī)械粉碎造成的破壞；經(jīng)超聲波處理后竹粉表面結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生改變，竹粉平滑的表面被破壞，表面出現(xiàn)很多孔洞，很多部位中腔結(jié)構(gòu)暴露，這些變化為生物酶的吸附提供了較多的附著位點(diǎn)，有助于生物酶水解效率的提高。此現(xiàn)象的產(chǎn)生原因?yàn)椋撼暡ǖ目栈?yīng)使組織間氣泡崩潰的同時(shí)，產(chǎn)生瞬間的高溫、高壓以及強(qiáng)大沖擊力，直接作用在竹粉上破壞了竹粉表面形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖5 超聲波處理前后竹粉的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM images of bamboo powder. (a) Original bamboo powder(×1 500)；(b) Original bamboo powder (×2 500)；(c) Ultrasonic-pretreated bamboo powder (×1 500)；(d) Ultrasonic-pretreated bamboo powder (×2 500)

2.5 化學(xué)結(jié)構(gòu)

原竹粉和超聲波處理后竹粉在4 000～400 cm-1范圍的紅外光譜圖如圖6所示。3 365 cm-1處的寬吸收帶是O—H的伸縮振動(dòng)，2 900 cm-1處的吸收峰是C—H的伸縮振動(dòng)峰，1 645 cm-1處的吸收峰是O—H結(jié)晶水的，在1 610、1 595和897 cm-1處的特征峰與木質(zhì)素相關(guān)，1 089和1 078 cm-1處的特征峰與半纖維素相關(guān)[13]，1 318 cm-1處為纖維素中C—H的變形振動(dòng)峰[14]。對(duì)比超聲波處理前后竹粉的紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)，譜圖并未發(fā)生明顯變化，這說(shuō)明超聲波處理并未引起竹粉化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，因此超聲波是一種溫和且有效的預(yù)處理方式。

圖6 超聲波處理前后竹粉的紅外光譜圖Fig.6 Fourier transform infrared spectra of bamboo powder before and after ultrasonic pretreatment

2.6 結(jié)晶度

原竹粉和超聲波處理后竹粉的X射線衍射圖譜如圖7所示。經(jīng)Jade分峰、擬合計(jì)算得到原竹粉的結(jié)晶度為47.09%，超聲波處理后竹粉的結(jié)晶度為35.41%，降低了11.68%。結(jié)晶度的降低與超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)破壞竹粉的結(jié)晶區(qū)有關(guān)。結(jié)晶度的降低代表竹粉的無(wú)定形比例增大，這樣竹粉的可及性提高，酶液更容易進(jìn)入竹粉內(nèi)部，水解效率增加。

圖7 超聲波處理前后竹粉的X射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction patterns of bamboo powder before and after ultrasonic pretreatment

3 結(jié) 論

1)在室溫浴比為1∶30的條件下，采用頻率為20 kHz，功率為960 W的超聲波處理竹粉15 min，使用中性纖維素酶水解，經(jīng)此條件預(yù)處理竹粉的產(chǎn)糖量較原竹粉最大提高了34.48%。

2)經(jīng)超聲波預(yù)處理后竹粉表面結(jié)構(gòu)被破壞，可直接接觸比表面積增加，使得酶液更易與竹粉接觸，生物酶水解效率提高。

3)超聲波預(yù)處理前后與木質(zhì)素、半纖維素、纖維素相關(guān)的特征峰并未發(fā)生明顯變化，表明超聲波處理對(duì)竹粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響。

4)超聲波預(yù)處理竹粉結(jié)晶度較原竹粉降低了12.90%，使得酶液更易進(jìn)入竹粉內(nèi)部，生物酶水解效率增加。FZXB

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Influence of ultrasonic treatment on cellulase hydrolysis of bamboo powder

DU Xiaoying1， FU Jiajia1,2， WANG Hongbo1， GAO Weidong1， JIANG Chunyan3

(1.JiangsuEngineeringTechnologyResearchCenterforFunctionalTextiles,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China； 2.NationalEngineeringLaboratoryforModernSilk,SoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215123,China； 3.WotoProtection&Tech.Co.,Ltd.,Jiangyin,Jiangsu214413,China)

The complicated and compacted structure of bamboo hindered the effect of enzymatic hydrolysis when the enzymatic degumming of bamboo was carried out. Therefore, ultrasound was employed to pretreat bamboo powders prior to enzymatic treating with the purpose of improving the efficiency of cellulase hydrolysis on bamboo powder. Results from univariate analysis indicated the preferred ultrasonic pretreatment should be carried out at room temperature for 15 min with the bath ratio of 1∶30, the frequency of 20 kHz, and the power of 960 W. Under the same conditions, the reducing sugar yield from cellulase hydrolysis of ultrasonic-pretreated bamboo powder increased by 34.48% compared with bamboo powder without pretreatment after the reaction for 12 h. The changes in surface structure, chemical components and crystallinity of bamboo powder with and without ultrasonic pretreatment were evaluated by scanning electron microscopy, infrared spectroscopy and X-ray diffraction. The results demonstrated that the surface structure of bamboo powders is damaged，and the number of gap and pores is increased, thus the valid surface for enzyme binding increased. The crystallinity of ultrasonic treated bamboo was decreased by 11.68% but chemical structure showed no significant change. These results suggest that ultrasonic pretreatment is effective and mild without changing the properties of bamboo.

ultrasonic； cellulase； bamboo powder； reducing sugar； crystallinity

10.13475/j.fzxb.20160104905

2016-01-22

2016-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31470509，31201134)；江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃(自然科學(xué)基金)青年基金項(xiàng)目(BK2012112)；江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性研究項(xiàng)目(BY2013015-24)；現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室技術(shù)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(蘇州大學(xué)絲綢工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題)(KJS1312)

杜曉瑩(1989—)，女，碩士生。研究方向?yàn)楣δ芗徔棽牧?。傅佳佳，通信作者，E-mail: kathyfjj@126.com。

TS 102.2

A