蜂糧中芽孢桿菌的分離鑒定及其耐酸耐高糖特性的分析

張言周， 王 爽， 李韻雅， 蔡宇杰， 廖祥儒

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

蜂糧中芽孢桿菌的分離鑒定及其耐酸耐高糖特性的分析

張言周， 王 爽， 李韻雅， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

為豐富人工發(fā)酵蜂花粉生產(chǎn)蜂糧的菌種資源，從天然蜂糧中篩選芽孢桿菌。通過平板涂布法從中蜂蜂糧樣品中分離產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，利用16S rRNA基因同源比對及系統(tǒng)發(fā)育分析對其進(jìn)行初步鑒定，并分析其耐酸耐高糖特性。共分離到16株隸屬于Bacillus tequilensis、Bacillus aerophilus、Fictibacillus nanhaiensis、Bacillus sonorensis、Lysinibacillus xylanilyticus、Lysinibacillus fusiformis、Bacillus invictus、Bacillusmethylotrophicus的芽孢桿菌。其中10株菌能在低酸和高糖條件下正常生長，菌株Br7、Br9和Br11的芽孢生成量較少，有潛力應(yīng)用于人工發(fā)酵蜂花粉制備蜂糧。

芽孢桿菌；蜂糧；蜂花粉

蜂糧作為一種純天然的發(fā)酵食品，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，目前已經(jīng)成為一種極具開發(fā)前景的保健食品，具有抗疲勞、美容保健、增強(qiáng)免疫力和記憶力等生理功能[1]。蜂糧也稱蜂巢花粉，是雄蜂和工蜂的主要營養(yǎng)供給，是蜂花粉經(jīng)過一系列復(fù)雜的過程轉(zhuǎn)化而成，包括蜂花粉的采集、乳糜狀花粉團(tuán)的調(diào)制以及花粉團(tuán)的微生物發(fā)酵釀制[2-3]。其中花粉團(tuán)的微生物發(fā)酵釀制是蜂糧形成的關(guān)鍵，也是影響蜂糧品質(zhì)的決定因素，蜂糧具有復(fù)雜的微生物系統(tǒng)[4-5]。天然蜂糧僅能在蜂巢中由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，產(chǎn)量有限，而且又是蜂群幼蟲的食物，大量采取會對蜂群的繁殖產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此天然蜂糧至今無法在市場上大規(guī)模的銷售[1]。

為了滿足蜂糧的巨大市場需求，眾多研究者試圖利用從天然蜂糧中分離的關(guān)鍵微生物發(fā)酵蜂花粉來實現(xiàn)蜂糧的規(guī)模化生產(chǎn)，這就需要全面分析蜂糧發(fā)酵中的微生物組成及變化。天然蜂糧是一個復(fù)雜的微生物體系，從中已分離到多種微生物，包括乳酸菌、酵母菌、霉菌以及芽孢桿菌等。過去對巢房中蜂糧發(fā)酵過程中微生物活動的分析表明：第一階段為乳酸菌、酵母菌以及某些好氧細(xì)菌利用花粉中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖；第二階段厭氧乳酸菌（如鏈球菌）利用酵母菌產(chǎn)生的生長素生長繁殖，引起花粉團(tuán)的pH降低并產(chǎn)生B族維生素；第三階段，乳鏈球菌消失，能產(chǎn)更多酸的乳酸桿菌開始生長；第四階段由于積累的乳酸濃度過高，從而抑制了乳酸菌和酵母菌的生長，乳酸菌和某些酵母菌開始消失。此時蜂花粉pH接近4，蜂糧釀制完成[6-7]。但這一過程中并未見到芽孢桿菌活動情況的分析，而在成熟蜂糧中已有不少芽孢桿菌被分離到，例如，Gilliam等（1989）從杏仁花粉、蜂花粉和1、3、6周蜂糧樣品中分離到芽孢桿菌屬的6種芽孢桿菌41個菌落[8]。其中，枯草芽孢桿菌是蜂糧中常見的細(xì)菌，可能是蜜蜂在酸制過程中添加到蜂糧中的[6，9]。

在人工生產(chǎn)蜂糧的探索中，主要是應(yīng)用從天然蜂糧中篩選的乳酸菌或酵母菌來發(fā)酵蜂花粉[10-12]。與天然蜂糧的發(fā)酵相比，微生物菌種過于單一，無論是營養(yǎng)以及風(fēng)味均與天然蜂糧相去甚遠(yuǎn)。尤其是天然蜂糧中的芽孢桿菌，其在蜂糧的發(fā)酵釀制中可能發(fā)揮著重要作用。但是，尚沒有將芽孢桿菌應(yīng)用到人工發(fā)酵蜂花粉的實踐中。同時，為提高人工發(fā)酵蜂糧的品質(zhì)，除了常用的乳酸菌及酵母菌，需要篩選更加豐富的菌種應(yīng)用到蜂糧的人工發(fā)酵中，而天然蜂糧中豐富的芽孢桿菌將是不錯的選擇。因此，作者將從采自廣西某蜂場的中蜂蜂糧中篩選芽孢桿菌，并對篩選到的芽孢桿菌進(jìn)行初步的分子鑒定，分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。并對這些芽孢桿菌的耐酸、耐高糖特點及低酸高糖條件下芽孢的生成進(jìn)行了分析，為人工發(fā)酵蜂花粉生產(chǎn)蜂糧奠定豐富的芽孢桿菌菌種資源，對于蜂花粉的深加工及蜂糧制品的開發(fā)具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 蜂糧樣品 采自廣西巴馬某蜂場的蜂巢，蜂種為東方蜜蜂（中蜂，Apiscerana cerana），采收季節(jié)為秋季。采收的蜂糧樣品置于預(yù)先準(zhǔn)備的無菌樣品瓶，于室溫條件下放置于陰涼通風(fēng)處。

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏5 g；蛋白胨10 g；氯化鈉5 g；pH 7.0~7.2；NB瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g；蛋白胨 10 g；氯化鈉 5 g；瓊脂 20 g；pH 7.0~7.2；耐高糖檢驗培養(yǎng)基：含葡萄糖的NB培養(yǎng)基，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%，30%，40%，50%；耐酸檢驗培養(yǎng)基：不同pH值的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，pH分別為4.5、4.0、3.5；種子培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選 稱取2 g蜂糧樣品，用滅菌生理鹽水稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%，取200μL稀釋液涂布在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，于超凈工作臺靜置30 min后30℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取合適尺寸的菌落，通過劃線分離純化單菌落，轉(zhuǎn)接并保藏菌種[13]。

1.2.2 產(chǎn)芽孢菌株的鑒定 將保存的菌株用NB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)至48 h，挑取少許菌落進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果并確定有無芽孢的產(chǎn)生。

1.2.3 菌株16S rRNA基因擴(kuò)增 利用NB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)保存的菌株，收集菌體，利用生工細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′為上下游引物，通過PCR擴(kuò)增各菌株的16S rRNA基因[14]。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板 2μL、10×PCR Buffer 5μL、2.5 mM dNTP 4μL、10μM上下游引物各2μL、Taq酶

2μL，雙蒸水35μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min，94℃30 s，55℃40 s，72℃90 s，72℃5min，32個循環(huán)。取5μL PCR產(chǎn)物電泳檢測，其余產(chǎn)物純化后與克隆載體pMD 18T載體相連，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中并送往上海生工進(jìn)行測序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將各菌株16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLASTN比對，檢索同源序列，并用 MEGA 4.0.2軟件采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，以確定菌種在進(jìn)化中的位置。并將各菌株的16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 菌株耐高糖特性的檢驗 由于天然蜂糧混有蜂蜜，且經(jīng)發(fā)酵之后其含糖量較高，所以其含有的原生菌株應(yīng)該在發(fā)酵過程中能夠忍耐高濃度糖的脅迫。因此，用含不同濃度葡萄糖的NB培養(yǎng)基檢驗各菌株耐高糖特性，記錄各菌株在不同糖濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的菌體濃度（以培養(yǎng)液在600 nm的吸光值表示）。以過夜培養(yǎng)的各菌株為種子液，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量轉(zhuǎn)接入不同糖濃度的3 mLNB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.2.6 菌株耐酸性檢驗 由于天然蜂糧發(fā)酵中最明顯的變化就是蜂花粉pH的降低，因此用不同pH的NB培養(yǎng)基檢驗各菌株的生長極限pH。以過夜培養(yǎng)的各菌株為種子液，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量轉(zhuǎn)接入不同pH的3mL NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，記錄各菌株的菌體濃度 （以培養(yǎng)液在600 nm的吸光值表示）。

1.2.7 菌株在低酸高糖條件下形成芽孢的特性主要考察各菌株在低酸高糖（pH 4.0，30%糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)）條件下培養(yǎng)24 h形成芽孢的情況，因為在酸性和高滲透壓（高糖濃度引起）條件下，芽孢桿菌會通過形成芽孢以耐受低酸高糖的脅迫，但芽孢是休眠體，無法作用于蜂糧的發(fā)酵。因此，只有那些在低酸高糖條件下能正常生長，芽孢生成量較小的菌株才有可能在蜂糧的發(fā)酵中發(fā)揮作用。芽孢生成量的測定采用分光光度法測定芽孢中的吡啶二羧酸（DPA）的含量進(jìn)行，芽孢量用單位質(zhì)量菌體DPA含量的多少表示即每毫克菌體干質(zhì)量含有多少微克（μg）DPA[15]。測定原理是芽孢在萌芽、水解，或加熱過程釋放DPA。利用二價鐵離子和DPA形成的復(fù)合物形成的顏色，在440 nm有吸收，對芽孢進(jìn)行檢測。但這種復(fù)合物不穩(wěn)定，可加入還原劑如抗壞血酸可使復(fù)合物穩(wěn)定2 h。其變色范圍在pH 4.0～6.0。芽孢中DPA的釋放采用121℃高溫高壓滅菌的方法進(jìn)行[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因擴(kuò)增與測序

經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色檢驗，共從蜂糧樣品中篩選到16株產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，編號為Br1-16。對這16株菌的16S rRNA基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，利用1 g/dL瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行了電泳分析，大小如圖1所示，16株菌的擴(kuò)增序列條帶大小介于1 000于1 500 bp之間。對這16個PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測序，得到的序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號如表1所示。

圖1 分離自蜂糧的產(chǎn)芽孢細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of 16S rRNA genes from spore-form ing bacteria isolated from bee bread

2.2 16S rRNA基因同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用BLASTN將16株細(xì)菌的16S rRNA基因序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，序列同源性達(dá)大于98%的模式菌，將是判斷16株細(xì)菌歸屬的重要依據(jù)。如表1所示，菌株Br1，Br6和Br11的16S rRNA基因均與模式菌 Bacillus tequilensis KCTC 13622T的同源性大于99%，但系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）表明這3株菌是不同的，菌株Br11比Br1和Br6與模式菌有著更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。與另外13株菌相比，這3株菌與枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis NCIB 3610T）有著較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。菌株Br2、Br3、Br10與模式菌株 Bacillus aerophilus 28KT的16S rRNA基因相似度均大于99%，但只有菌株Br10與模式菌處在同一系統(tǒng)進(jìn)化樹分支上（圖2）。盡管同源比對表明菌株 Br12與模式菌 Bacillus invictus Bi.FFUP1T有著較高的同源性，但系統(tǒng)發(fā)育分析顯示Br12與模式菌Bacillus aerophilus 28KT可能有著更近的發(fā)育關(guān)系。

表1 分離自蜂糧的產(chǎn)芽孢細(xì)菌16S rRNA基因序列同源性比對結(jié)果Table 1 Homologous analyses of 16S rRNA gene sequences of spore-form ing bacteria isolated from bee bread

圖2 蜂糧中產(chǎn)芽孢細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the spore-form ing bacteria isolated from bee bread

16S rRNA基因同源比對分析表明，菌株Br7、Br9和 Br13與模式菌 Lysinibacillus xylanilyticus XDB9T同源性均在99%左右，Br8和Br14與模式菌Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717T的同源性約為99%。但是，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株Br13與非模式菌Lysinibacillus fusiformis R6有著更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Br7和Br9處在同一個系統(tǒng)進(jìn)化樹分支上，Br8和Br14也處在同一分支上，它們極有可能是來自于同一株菌的不同菌落，這需要通過以后的生理生化實驗去驗證。相似的情況也出現(xiàn)在菌株Br15和 Br16上， 它們均與模式菌 Bacillus methylotrophicus CBMB205T有著大于 99%的 16S rRNA基因相似度。最后，同源比對及系統(tǒng)發(fā)育分析均表明菌株 Br4和 Br5分別與模式 Fictibacillus nanhaiensis JSM 082006T和 Bacillus sonorensis NBRC 101234T有著相同的歸屬關(guān)系。

通過以上的分析表明，從蜂糧樣品中分離到的16株能形成芽孢的細(xì)菌均是芽孢桿菌，這16株芽孢桿菌隸屬于8個不同的種，這需要生理生化鑒定去進(jìn)一步驗證。

2.3 菌株耐高糖特性

如表2所示，16株菌在含不同濃度葡萄糖的NB培養(yǎng)基中的生長情況用培養(yǎng)物在600 nm的吸光值表示。與不含葡萄糖時相比，質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的葡萄糖不同程度地促進(jìn)了16株芽孢桿菌的生長。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至30%時，16株菌的生長明顯受到抑制。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高至40%時，共有5株菌 （Br6、Br10、Br11、Br12、Br15）的OD600低于1，而菌株Br7和Br9生長受到抑制的較輕。在50%的糖濃度下，16株芽孢桿菌均不能生長。

表2 分離自蜂糧的芽孢桿菌在不同濃度葡萄糖下的生長差異Table 2 Grow th difference of Bacillus strains isolated from bee bread under different glucoseconcentration

菌株 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 0 20 30 40 50 Br11 2.13 2.87 1.65 0.87 -Br12 2.72 3.24 1.98 0.74 -Br13 3.65 4.75 2.34 1.54 -Br14 4.17 5.12 3.15 1.87 -Br15 1.52 2.68 1.02 0.97 -Br16 4.82 5.66 3.87 2.46 -

2.4 菌株耐酸特性

如表3所示，16株芽孢桿菌在不同pH條件下的生長差異用培養(yǎng)物在600 nm的吸光值表示。菌株Br8、Br13和Br14在pH4.5的條件下完全不能生長，當(dāng)pH值降低至4.0時菌株Br3、Br10和Br12的生長也完全被抑制。當(dāng)pH繼續(xù)降低至3.0時，只有Br2、Br7、Br9和Br11生長的較好。而Br4、Br5和Br6 3株菌在pH 3.0時，其培養(yǎng)物在600 nm的吸光值均小于1。

表3 分離自蜂糧的芽孢桿菌在不同pH條件下的生長差異Table 3 Grow th difference of Bacillus strains isolatedfrom bee bread under pH 4.5，4.0 and 3.5

2.5 菌株在低酸高糖條件下形成芽孢的特性

天然蜂糧的酸度一般在pH 4.0左右，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在30%左右，所以選擇在pH 4.0和30%糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下，考察10個菌株在培養(yǎng)24 h后芽孢生成量的差異，芽孢量的差異以每毫克菌體干重中所含DPA量的差異表示。如圖3所示，菌株Br7、Br9和Br11在培養(yǎng)24 h后生成的芽孢量遠(yuǎn)小于其它菌株，菌株Br4和Br15生成的芽孢量最多。

圖3 10株芽孢桿菌在低酸（pH 4.0）高糖（30%）條件下培養(yǎng)24 h后形成芽孢量的差異Fig.3 Difference of spore production of ten Bacillus strains cultured for 24 h under pH 4.0 and 30% of glucose

3 結(jié)語

從采自廣西某蜂場的中蜂蜂糧中共篩選到16株產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA基因同源比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，這 16株菌分別隸屬于 Bacillus tequilensis、 Bacillus aerophilus、 Fictibacillus nanhaiensis、 Bacillus sonorensis、 Lysinibacillus xylanilyticus、 Lysinibacillus fusiformis、 Bacillus invictus、Bacillusmethylotrophicus。通過對16株菌的耐高糖及耐酸特性的對比，結(jié)合天然蜂糧低酸高糖的特點，共挑選出10株菌檢驗其在pH4.0和30%糖濃度的條件下生成芽孢量的差異。結(jié)果表明菌株Br7、Br9和Br11在低酸高糖的條件下芽孢生成量較低，因此，作者認(rèn)為這3株菌可能在天然蜂糧的發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用，它們將作為候選菌株用于蜂花粉的人工模擬發(fā)酵。下一步的重點將是考察它們的安全性及探索其應(yīng)用于蜂花粉發(fā)酵的條件。

參考文獻(xiàn)：

[1]DUAN Chuanren，BAO Jiafang，SHIYisong，etal.Isolation and identification ofm icrobe in loquat flower and rape flower bee bread[J].Science and Technology of Food Industry，2015，36（5）：175-180.（in Chinese）

[2]NAGAI T，NAGASHIMA T，NAGAIT，et al.Preparation and functional properties of extracts from bee bread[J].Food/ Nahrung，2004，48（3）：226-229.

[3]O’TOOLEC，RAW A.Beesof theWorld[M].Blandford Press，1991.

[4]HUANGWencheng.M icroorganism is important for nutrition and health of swarm[J].Apiculture of China，2010，61（4）：54-55.（in Chinese）

[5]BRINDZA J，GROFJ，BACIGALOVA K，etal.Pollenm icrobialcolonization and food safety[J].Acta Chim ica Slovaca，2010，3（1）：95-102.

[6]HAYDEN C.M icrobiology of pollen and bee bread：The genus Bacillus[J].Apidologie，1979，10（3）：269-275.

[7]ISIDOROVA V A，ISIDOROVAB A G，SCZCZEPANIAKA L，et al.Gas chromatographic-mass spectrometric investigation of the chemical composition ofbeebread[J].Food Chem istry，2009，115：1056-1063.

[8]GILLIAM M，PREST D B，LORENZ B J.M icrobiology of pollen and bee bread：taxonomy and enzymology of molds[J]. Apidologie，1989，20：53-68.

[9]SU Songkun，CHEN Shenglu，YU Xuping，etal.Isolation and identification of bacteria from pollen and bee bread[J].Journal of Zhejiang University（Agric.&Life Sci.），2001，27（6）：627-630.（in Chinese）

[10]FOOTEH L.Possible use ofmicroorganisms in synthetic bee bread production[J].Amer Bee J，1957，97：476-478.

[11]HAYDEN C.M icrobiology of pollen and bee bread：The Genus Bacillus[J].Apidologie，1979，10（3）：269-275.

[12]JIBaozhong，LIU Shuwen，XU Lina，et al.Advances on the bee bread research[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2006，22（8）：165-169.（in Chinese）

[13]WEI Juan，HE Dongxu，LIGuohong，et al.Isolation and identification of endophytic bacteria in Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch）and phylogenetic analysis[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2015，34（2）：165-169.（in Chinese）

[14]HAN Huili，CAIYujie，GUAN Zhengbing，et al.Screening and identification and study on antim icrobial activity of bacterial isolates from honey[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（2）：148-154.（in Chinese）

[15]GHOSH J，LARSSON P，SINGH B，etal.Sporulation inmycobacteria[J].Proceedings of the National Academ y of Sciences，2009，106（26）：10781-10786.

[16]WANG L，LIN Y M.Spore detection in aerobic granules by different dipicolinic acid releasing methods[J].Bioresource Technology，2007，98：3164-3167.

Isolation and Identification of Bacillus Strains From Bee Bread and Their Tolerance to Acid and G lucose

ZHANG Yanzhou， WANG Shuang， LIYunya， CAIYujie， LIAO Xiangru*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Bacillus strainswere isolated from natural bee bread to enrich m icrobes producing bee bread from the fermentation of bee pollen.Strains were isolated based on the homologous alignmentusing spread platemethodandprelim inaryidentified using phylogenetic analysis of the 16S rRNA genes.Theirtolerance to acidand glucosewas also discussed.Sixteen spore-form ing bacteria were totally isolated from bee bread of Apissinensis and identified as the genus of Bacillus tequilensis，Bacillus aerophilus，F(xiàn)ictibacillusnanhaiensis，Bacillus sonorensis，Lysinibacillusxylanilyticus，Lysinibacillusfusiformis，Bacillus invictus and Bacillus methylotrophicus，respectively. However，only ten Bacillus strains could grow vigorously at low pH （4.0）w ith high glucose concentration（30%）.Fewer spores were produced by the strain Br7，Br9 and Br11，which were suggested as the potentialstrainsused forartificial fermentation ofbee pollen.

Bacillus，bee bread，bee pollen

Q 81

A

1673—1689（2017）04—0410—06

2015-04-27

江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻項目（BY2014023-28）；無錫市科技發(fā)展農(nóng)業(yè)支撐項目（CLE01N1310）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目。

*通信作者：廖祥儒（1964—），男，江西南康人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事資源微生物的篩選及工業(yè)應(yīng)用研究。

E-mail：liaoxiangru@163.com

張言周，王爽，李韻雅，等.蜂糧中芽孢桿菌的分離鑒定及其耐酸耐高糖特性的分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（04）：

410-415.