太平洋鱈抗凍基因AFP4的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

呂繪倩,蔣潔蘭,姜志強(qiáng),毛明光

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實室,遼寧大連116023)

太平洋鱈抗凍基因AFP4的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

呂繪倩,蔣潔蘭,姜志強(qiáng),毛明光

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實室,遼寧大連116023)

為進(jìn)一步研究太平洋鱈Gadus macrocephalus抗凍蛋白AFP4的功能,通過RT-PCR方法克隆得到太平洋鱈4型抗凍蛋白基因(AFP4)的開放閱讀框(open reading frame,ORF),構(gòu)建原核表達(dá)載體并優(yōu)化表達(dá)條件,利用純化的重組蛋白制備多克隆抗體,采用間接ELISA法檢測抗體的效價,用Western-blot法分析重組蛋白的免疫原性。結(jié)果表明:AFP4基因編碼區(qū)長度為375 bp,編碼125個氨基酸;將AFP4基因的ORF與載體pET-32a連接,構(gòu)建重組體pET-32a-AFP4,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中;經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)和條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)該重組體在37℃、0.01 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)3 h獲得最大的表達(dá)量;對該重組蛋白進(jìn)行純化,利用純化的蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,采用間接ELISA法檢測該抗體效價為1∶1 600 000;Western blot分析顯示,重組蛋白可以與兔抗AFP4多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,表明該重組蛋白具有免疫原性。本研究結(jié)果可為深入研究太平洋鱈AFP4蛋白功能提供理論依據(jù)。

太平洋鱈;抗凍基因;原核表達(dá);抗體

抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱,存在于多種生物體內(nèi),動物、植物、細(xì)菌和真菌等均能夠產(chǎn)生抗凍蛋白[1-3]?？箖龅鞍椎淖饔迷硎且苑且罃?shù)性形式降低水溶液的冰點,但對熔點影響甚微,從而導(dǎo)致水溶液的熔點與冰點間出現(xiàn)差值,這種差值稱為熱滯活性或抗凍活性,差值越大,抗凍活性就越大。因而,抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白(Thermal hysteresis proteins,THPs)。目前,魚類AFPs根據(jù)其氨基酸組成、結(jié)構(gòu)特點和發(fā)現(xiàn)的先后順序,分為抗凍糖蛋白(Antifreeze glycoprotein, AFGP)[1-2,4],以及1型[3,5]、2型[6-7]、3型[8-9]、4型抗凍蛋白(Antifreeze protein)[10-11]和高活性抗凍蛋白(Hyperactive antifreeze protein,HAFP)[12]。4型抗凍蛋白是Deng等[13-14]從長角杜父魚Myoxocephalus octodecimspinosis血清中分離得到的一種新型抗凍蛋白,該蛋白含有108個氨基酸,相對分子量約為12 300,其前體蛋白為128個氨基酸,Gln含量高達(dá)17%,其N末端被焦谷氨酰基團(tuán)所封閉。魚類AFP4蛋白中α螺旋的含量很高(1℃時高達(dá)60%),由4個螺旋折疊成一個螺旋束[14-16],其氨基酸序列與載脂蛋白具有一定的同源性[17]。

目前,關(guān)于AFP4蛋白的研究只在異育銀鯽Carassiusauratus gibelio[18]、大黃魚Larimichthys crocea[19]、斑馬魚Danio rerio[20]等少數(shù)魚類中曾有報道,且對于AFP4蛋白的功能仍存在爭議,研究認(rèn)為其可能含有抗凍活性,除具有結(jié)合冰晶的功能外,AFP4還可能具有結(jié)合配體和保護(hù)尚未產(chǎn)生血液循環(huán)系統(tǒng)的胚胎的功能。

太平洋鱈Gadus macrocephalus又名大頭鱈,分布于太平洋北部沿岸海域,是中國北方乃至世界的重要海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一[4]。太平洋鱈屬冷水性底層魚類[21],之所以能在低溫環(huán)境中生活,可能與其體內(nèi)的某些抗凍蛋白相關(guān)。已有研究從太平洋鱈肝組織轉(zhuǎn)錄組中獲得了AFP4(GenBank:KX-430014)基因的片段序列[22],為進(jìn)一步研究AFP4蛋白的功能,本試驗中利用RT-PCR技術(shù)克隆得到太平洋鱈AFP4的ORF,對序列進(jìn)行初步分析,將其與原核表達(dá)載體pET-32a連接,成功構(gòu)建原核表達(dá)載體,并進(jìn)行了原核表達(dá)條件優(yōu)化以及多克隆抗體的制備等,旨在為深入研究太平洋鱈AFP4蛋白的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚為野生太平洋鱈成年雌魚,捕撈于大連市黑石礁海域,體質(zhì)量為1.74 kg。

TriPure Isolation Reagent購自Roche公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptRTreagentKit)、pMD18-T vector、限制性核酸內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司;親和層析柱(ProteinISOTMNi-NTA Resin)、IPTG、2×EasyTaq PCR SuperMix、Easy Pure Plasmid MiniPrep質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司;瓊脂粉(Agar)、氨芐青霉素(Amp)、San Prep柱式DNA膠回收試劑盒、AP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自生工生物工程(上海)股份有限公司;弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑購自Sigma公司;HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化(北京)科技有限公司;PVDF膜、NBT/BCIP顯色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;表達(dá)載體pET-32a、感受態(tài)細(xì)胞DH5α及BL21(DE3)為遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實室保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 取太平洋鱈肝組織20 mg,按照TriPure Isolation Reagent使用說明書提取總RNA,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測、紫外可見分光光度計鑒定(確定)RNA質(zhì)量和濃度,于超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆谩⑼暾暂^好的RNA按照PrimeScript RT reagent Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AFP4基因的克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)太平洋鱈肝組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的AFP4基因片段序列[23],運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一對特異性引物,AFP4-F:5′ATGAAATACACACTCATCGC 3′,AFP4-R:5′CTGGGCGATGGCCTTGGCCTGG 3′。以太平洋鱈肝組織RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)程序為:95℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,62℃下退火復(fù)性30 s,72℃下延伸1 min,共進(jìn)行34個循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將回收純化的目的片段AFP4與pMD18-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。挑取單克隆,利用通用引物M13(M13-F:5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′,M13-R:5′AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3′)對菌落進(jìn)行PCR鑒定,取陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。利用DNAMAN和ORF Finder軟件進(jìn)行分析并推測其氨基酸序列;利用ExPASy服務(wù)器(http://www.expasy.org/proteomics)在線ProtParam、Compute pI/Mw工具預(yù)測AFP4蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其條件優(yōu)化 對鑒定后的重組菌pET-32a-AFP4進(jìn)行質(zhì)粒抽提。將質(zhì)粒pET-32a-AFP4轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,并涂布于含Amp抗性的LB培養(yǎng)基中,于37℃下過夜培養(yǎng)。挑取單克隆接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),待吸光度OD600nm為0.6左右時,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),于37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)6 h,以未加誘導(dǎo)劑的菌液為對照,誘導(dǎo)結(jié)束后離心并收集菌體,用PBS緩沖液懸浮,參照Mao等[22]的SDSPAGE電泳方法檢測目的蛋白表達(dá)情況。

在檢測重組蛋白得到表達(dá)的情況下,對重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化:

(1)在IPTG終濃度分別為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mmol/L的條件下,于37℃下誘導(dǎo)6 h后收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

(2)在IPTG濃度為1 mmol/L的條件下,于37℃下分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6 h后收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

(3)在IPTG濃度為1 mmol/L的條件下,分別于18、28、37℃條件下,誘導(dǎo)6 h后離心收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 重組蛋白的純化 將含有重組質(zhì)粒pET-32a-AFP4的BL21菌株接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,按最佳優(yōu)化條件進(jìn)行表達(dá),離心收集菌體蛋白,冰浴超聲破碎(超聲5 s、暫停5 s,持續(xù)40 min),以12 000 r/min離心15 min,分別收集上清與沉淀。利用ProteinISOTMNi-NTA Resin試劑盒純化重組蛋白,分別收集各步樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測。

1.2.6 多克隆抗體的制備 取2只新西蘭大白兔分成A、B兩組,用純化后的蛋白免疫兔子。將純化所得的AFP4重組蛋白與弗式完全佐劑等體積完全混合,經(jīng)乳化后在兔子背部進(jìn)行皮下多點注射,以后每隔7 d取300 μg的AFP4重組蛋白與弗氏不完全佐劑等體積完全混合,同樣方法加強(qiáng)免疫6次,于第6次免疫后的第7天從兔子頸動脈采血(兔子在采血前禁食1 d)。血液收集于經(jīng)滅菌的1.5 mL離心管中,4℃下靜置過夜,再以1500 r/min離心10 min,收集血清于冰箱(-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 多克隆抗體效價檢測及特異性分析 將純化所得重組蛋白AFP4作為抗原包被ELISA板, BSA在4℃下封閉過夜,血清按1∶3.125×103/ 6.25×103/12.5×103/25×103/50×103/100×103/200× 103/400×103/800×103/1600×103/3200×103/6400× 103的比例進(jìn)行稀釋,并加入到反應(yīng)孔中,37℃下孵育2 h,同時用His抗體作為陽性對照,以BSA作為陰性對照。用去離子水沖洗干凈后,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗,37℃下孵育2 h。用去離子水洗滌后加入顯色液,37℃下反應(yīng)15 min,加入硫酸終止反應(yīng),于450 nm波長下測定吸光值。參照Mao等[23]的Western-blot方法,將純化所得重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(100 V,2 h),4℃下封閉過夜。兔抗AFP4重組蛋白血清為一抗,羊抗兔IgG-AP為二抗,進(jìn)行抗原抗體反應(yīng),經(jīng)NBT/TCIP顯色液處理顯色,用去離子水洗滌停止反應(yīng),觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1AFP4基因的克隆及分析

利用RT-RCR方法擴(kuò)增得到太平洋鱈AFP4基因ORF序列。序列分析結(jié)果顯示,AFP4的ORF長度為375 bp,編碼125個氨基酸(圖1)。Prot-Param預(yù)測PI/MW顯示:該蛋白的理論分子量約為13 975,理論等電點PI為4.68;不穩(wěn)定系數(shù)為44.18,表明該蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定;總平均疏水指數(shù)為-0.145,表明該蛋白可能是一種親水蛋白。

圖1 太平洋鱈AFP4基因的開放閱讀框及其推導(dǎo)的氨基酸序列(*終止密碼子)Fig.1 The open reading frame and deduced amino acid sequence of theAFP4 in Pacific cod(*termination codon)

2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-AFP4的構(gòu)建與鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-AFP4轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后,以T7為通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測(圖2),菌液PCR檢測9個單菌落有1000 bp左右的條帶,僅一個未出現(xiàn)任何條帶。取陽性單克隆菌落進(jìn)行測序驗證,結(jié)果顯示,AFP4正確連接到表達(dá)載體pET-32a中,表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-AFP4轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,以空載pET-32a的菌液和無誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-AFP4菌液作為陰性對照,在濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h的情況下,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,結(jié)果顯示,在31 000處出現(xiàn)特異性條帶(圖3),條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致,陰性對照則無此條帶,結(jié)果表明, AFP4在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中得到正確表達(dá)。

采用Quantity one軟件對外源蛋白的表達(dá)量進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示,外源蛋白表達(dá)量占菌體蛋白表達(dá)量的10.55%左右。

通過誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度3方面的改變,對pET-32a-AFP4的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。在其他條件一致的情況下,誘導(dǎo)時間為3 h時融合蛋白表達(dá)量最高(圖4);不同誘導(dǎo)劑對融合蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果顯示,在IPTG濃度為0.01 mmol/L時,蛋白表達(dá)量最高(圖5);在其他條件一致的情況下,融合蛋白的表達(dá)量并未隨溫度的改變而發(fā)生改變(圖6),該結(jié)果表明,融合蛋白表達(dá)量對溫度的改變不敏感。一般來說,在25～37℃誘導(dǎo)下,外源蛋白易于以活性存在,在37℃以上誘導(dǎo),則易形成包涵體[24],故選擇37℃作為最佳誘導(dǎo)濃度。

圖2 重組質(zhì)粒菌落PCR檢測Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-32a-AFP4 using PCR

圖3 pET-32a-AFP4 SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant pET-32a-AFP4 expression

圖4 pET-32a-AFP4在不同誘導(dǎo)時間下表達(dá)的SDSPAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid pET-32a-AFP4 induced for different time

圖5 重組質(zhì)粒pET-32a-AFP4在不同濃度IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid pET-32a-AFP4 expression under various concentrations of IPTG

2.4 重組蛋白純化、抗體效價檢測和特異性分析

由于表達(dá)載體pET-32a中融合了6個His標(biāo)簽,便于純化,利用蛋白純化試劑盒純化重組蛋白,純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,約在相對分子質(zhì)量為31 000處出現(xiàn)特異性條帶(圖7-A)。重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得兔抗AFP4抗體后,利用間接ELISA方法檢測抗體效價,結(jié)果如表1所示。從表1可知,免疫的兩只新西蘭大白兔均產(chǎn)生免疫反應(yīng)。大于NC兩倍且大于并接近0.25的OD450nm值對應(yīng)的稀釋度值即為該抗體的效價,因此,A組效價為1∶800 000,B組效價較高,為1∶1 600 000。選擇效價高的B組新西蘭大白兔的抗血清進(jìn)行Western-blot分析,結(jié)果(圖7-B)表明,免疫后的抗血清出現(xiàn)明顯的特異性條帶,而陰性對照未出現(xiàn)特異性條帶。表明該重組蛋白具有免疫原性。

表1 間接ELISA檢測兔血AFP4血清效價Tab.1 Serum titer detected using indircet ELISA

圖6 重組質(zhì)粒pET-32a-AFP4在不同溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of pET-32a-AFP4 expression at different temperature

圖7 Western-blot法檢測AFP4重組蛋白Fig.7 Recombinant AFP4 detection using Westernblot

3 討論

3.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇及表達(dá)條件優(yōu)化

極地海洋和北溫帶沿岸水域的冬季水溫一般在-1.9℃左右,這一溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一般海洋魚類血液的冰點(-0.8℃)[25],但許多海洋魚類冬季能夠在極地及北方沿海水域生存,是因為它們能分泌一種抗凍蛋白[13],這些蛋白能夠改變魚體體液的冰點,以保持魚類在海水冰點之下保持體液的流動性。自AFP4被發(fā)現(xiàn)以來,在多種生物體內(nèi)均有報道,但在太平洋鱈中未見相關(guān)報道,本試驗中利用RT-PCR技術(shù)成功獲得太平洋鱈AFP4的ORF序列,并實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的表達(dá)。

大腸桿菌具有遺傳背景清晰、操作簡單、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉和可快速大規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點[25],其表達(dá)外源基因產(chǎn)物遠(yuǎn)高于其他表達(dá)系統(tǒng),已成為應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)[26]。pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng),最初由Studier等利用與啟動子配套能高效轉(zhuǎn)錄特定基因的外源RNA聚合酶構(gòu)建的T7 RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)[27-28]。外源基因表達(dá)的產(chǎn)物可能會對大腸桿菌有一定的毒害作用,并影響其生長,一般采用在酵母中表達(dá)或融合表達(dá)[29]的方法。本研究中,采用了融合表達(dá)的方法,用pET-32a作為表達(dá)載體,因T7噬菌體信號控制著目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,因此,T7 RNA聚合酶未加入之前,AFP4基因幾乎不被轉(zhuǎn)錄和表達(dá),這將保證BL21能夠很好地生長到一定量;當(dāng)BL21長到一定數(shù)目時,加入IPTG誘導(dǎo)劑,致使其產(chǎn)生大量T7 RNA聚合酶,它能特異性地識別pET-32a表達(dá)載體中的T7強(qiáng)啟動子序列,從而使目的重組蛋白得以高效表達(dá)。同時表達(dá)載體中的硫氧還蛋白TrxA與目的基因融合表達(dá),增加了融合蛋白的溶解性,同時降低了對宿主細(xì)胞的毒害作用。在pET-32a表達(dá)載體的C端含有6個His標(biāo)簽序列, His標(biāo)簽序列較短,與其他標(biāo)簽載體相比,在降低對抗體特異性影響的同時還對Ni-NTA層析介質(zhì)上的Ni2+具有特異吸附能力,可以達(dá)到分離、純化重組蛋白的目的。由于在誘導(dǎo)過程中蛋白極易以包涵體形式存在于沉淀中而不易純化,本試驗中通過對誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度3個條件進(jìn)行優(yōu)化,以研究在哪種條件下融合蛋白易在上清中表達(dá)。結(jié)果表明,誘導(dǎo)溫度為37℃、IPTG濃度為0.01 mmol/L、誘導(dǎo)3 h條件下,融合蛋白的表達(dá)量最高。SDS-PAGE電泳檢測表明,AFP4基因以可溶性形式在大腸桿菌中高效表達(dá)。

3.2 融合蛋白的鑒定

關(guān)于抗凍基因的表達(dá),張曉等[19]對大黃魚4型抗凍蛋白基因進(jìn)行了原核表達(dá)及功能研究。但該研究中試驗對象與本研究不同,在大黃魚類中該基因的開放閱讀框編碼124個氨基酸,本研究中,太平洋鱈AFP4基因的開放閱讀框編碼125個氨基酸。張曉等[19]所表達(dá)的大黃魚4型抗凍蛋白是以可溶性形式存在,本試驗中太平洋鱈AFP4抗凍蛋白也是以可溶形式存在。張曉等在研究中所采用的原核表達(dá)載體為pGEX-4T-1,所用感受態(tài)細(xì)胞為E.coli TOP10[19],與本研究中所采用的表達(dá)載體及感受態(tài)細(xì)胞完全不同,所以在重組蛋白的表達(dá)量上有顯著差異。對于太平洋鱈AFP4表達(dá)的重組蛋白是否具有活性還需進(jìn)一步試驗驗證。本試驗中對于表達(dá)融合蛋白的檢測,采用了Western-blot方法,以純化的重組蛋白為探針,利用抗原與抗體間的反應(yīng),證明所表達(dá)的融合蛋白為太平洋鱈AFP4蛋白,用Western-blot結(jié)果顯示出的條帶與蛋白Marker對比,確認(rèn)條帶約在相對分子質(zhì)量為31 000的位置,證明表達(dá)的融合蛋白為AFP4。因為目的基因AFP4編碼的蛋白相對分子質(zhì)量約為13 975,表達(dá)載體pET-32a自身攜帶的硫氧還蛋白標(biāo)簽序列以及6個His標(biāo)簽序列(相對分子質(zhì)量約為18 300)三者一起融合表達(dá),融合表達(dá)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量是三者之和,約為31 000。這一結(jié)果與預(yù)測的抗凍蛋白氨基酸分子量大小相一致,有力地證明了太平洋鱈AFP4基因ORF的完整性和準(zhǔn)確性。本研究中成功獲得太平洋鱈抗凍基因AFP4的重組表達(dá)載體,能夠有效地進(jìn)行體外表達(dá),對該重組蛋白進(jìn)行純化后獲得了相應(yīng)的多克隆抗體,研究結(jié)果將為后續(xù)工作中開展AFP4功能驗證,以及大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了必要的基礎(chǔ),具有重要的參考價值。

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Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of antifreeze protein gene AFP4 in Pacific cod Gadus macrocephalus

Lü Hui-qian,JIANG Jie-lan,JIANG Zhi-qiang,MAO Ming-guang
(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Fish Applied Biology and Aquaculture in North China,Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The open reading frame(ORF)of typeⅣantifreeze protein was cloned from Pacific cod Gadus macrocephalus using RT-PCR to investigate the function of typeⅣantifreeze protein.The result showed that the ORF of AFP4 had 375 bp in length,encoding a polypeptide of 125 amino acids.The recombinant pET-32a-AFP4 was constructed by linking the AFP4 ORF with the pET-32a vector,and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3).The expressing conditions of the recombinant plasmid were optimized under various concentrations of thermal hysteresis protein(THP),induction time and temperature with the optimal expressing induction conditions of 0.01 mmol/L IPTG,3 h and 37℃.The recombinant protein was purified and used to immunize New Zealand white rabbit.The polyclonal antibody was obtained and tested using indirect ELISA,with the titer of 1∶1 600 000.The specific binding between recombinant protein and Rabbit anti-AFP4 polyclonal antibody indicated that the recombinant protein had high immunogenicity.The findings will provide the foundations for further understanding of AFP4 functions in Pacific cod.

Gadus macrocephalus;antifreeze gene;prokaryotic expression;antibody

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.02.001

2095-1388(2017)02-0127-07

Q786

:A

2016-05-18

國家自然科學(xué)基金資助項目(31302202);遼寧省教育廳科研項目(L2015076,L2013276);農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題(2014-MSENC-KF-12,2015-MSENC-KF-04)

呂繪倩(1989—),女,碩士研究生。E-mail:lvhuiqian12@163.com

毛明光(1982—),男,博士,副教授。E-mail:mmg@dlou.edu.cn