群體微囊藻附生細菌特性*

范 琦，肖惠杰，吳 強，汪水娟，李朋富

(南京大學生命科學學院，南京 210093)

群體微囊藻附生細菌特性*

范 琦，肖惠杰，吳 強，汪水娟，李朋富**

(南京大學生命科學學院，南京 210093)

附生細菌在微囊藻水華暴發(fā)過程中可能發(fā)揮了重要作用，但是，缺少關于微囊藻附生細菌特性的研究報道．本文從4種群體微囊藻(銅綠微囊藻、惠氏微囊藻、水華微囊藻和堅實微囊藻)中分離得到了18種附生細菌，分別隸屬于六大類群：α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、放線菌綱、纖維粘網(wǎng)菌綱和黃桿菌綱．BIOLOG板分析顯示除了α-變形菌綱中的2種細菌以及放線菌綱中的1種細菌以外，其余細菌都能夠利用10種以上的碳源．18種附生細菌中有12種具有趨化性，12種具有疏水性，14種具有自聚能力．除了黃桿菌綱菌株都具有親水性外，其余5大類群菌株都含有疏水性種類．六大類群中都含有具有趨化性和自聚能力的種類．每種微囊藻中的大多數(shù)附生細菌種類都能利用10種以上的碳源，都具有疏水性．每種微囊藻中至少有一組細菌表現(xiàn)出共聚能力．除了水華微囊藻外，其余3種微囊藻中附生細菌的大多數(shù)種類都具有趨化性．除了惠氏微囊藻外，其余3種微囊藻的附生細菌中大多數(shù)種類都具有自聚能力．結(jié)果顯示細菌旺盛的代謝潛力、趨化性、疏水性、自聚能力和共聚能力可能有利于附生細菌定殖于微囊藻群體．

微囊藻；附生細菌；多樣性；特性

藍藻水華是危害公共健康和環(huán)境安全的全球性問題．微囊藻(Microcystis)是在湖泊和水庫中形成藍藻水華的最常見藻類[1]．在自然界中微囊藻多以群體形態(tài)存在，群體的形成有利于微囊藻垂直遷移和抵御浮游動物的攝食，群體微囊藻比單細胞微囊藻具有更高的生存競爭優(yōu)勢，群體的形成是微囊藻形成優(yōu)勢并暴發(fā)水華的關鍵機制之一[1-2]．

附生細菌附著在微囊藻群體中生長，包括變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)和放線菌(Actinobacteria)等，其菌群組成不同于周圍水體中的游離細菌菌群[3-5]．附生細菌可能促進或者抑制微囊藻生長，誘導微囊藻群體的形成，一些附生細菌能降解微囊藻毒素，因此附生細菌在微囊藻水華暴發(fā)過程中可能發(fā)揮了重要作用[6-8]．但是，很少有關于微囊藻附生細菌特性的研究報道，這阻礙了對附生細菌生態(tài)學功能的深入理解．為了探討附生細菌定殖于微囊藻群體的機制，本文從微囊藻群體中分離附生細菌，并分析其組成、生化特性、趨化性、細胞表面疏水性以及自聚(autoaggregation)和共聚(coaggregation)能力．

1 材料與方法

1.1 微囊藻的培養(yǎng)與附生細菌的分離

惠氏微囊藻NJ-24(M.wesenbergii)、堅實微囊藻NJ-54(M.firma)、銅綠微囊藻NJ-177(M.aeruginosa)和水華微囊藻NJ-159(M.flos-aquae)于2011年8月從太湖采集和分離． 在50 ml三角瓶中加入無菌BG-11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)[9]，4株微囊藻在實驗室培養(yǎng)過程中一直呈現(xiàn)群體形態(tài)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為2500 lux，光暗周期為12 h∶12 h．

實驗室中培養(yǎng)一年后，在超凈臺中將微囊藻群體放在無菌的尼龍篩(孔徑20 μm)上，用無菌BG-11培養(yǎng)基沖洗10次，然后將群體微囊藻涂布在R2A固體培養(yǎng)基上[10]，30℃恒溫培養(yǎng)，根據(jù)固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量計算各菌株在總菌落數(shù)中所占比例．選取不同形態(tài)的菌落通過在R2A平板上劃線純化．

1.2 附生細菌的分子鑒定

參考Tillett等的方法提取細菌DNA[11]．采用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增附生細菌的16S rRNA基因部分序列．PCR擴增條件如下：94℃預變性1 min，接著為20個循環(huán)反應(94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min)，最后在72℃下延伸7 min．PCR產(chǎn)物由南京金斯瑞生物科技有限公司完成測序，所得DNA序列提交到GenBank中，并用BLAST找到最相似的序列．

1.3 附生細菌的生化特性

收集對數(shù)期的細菌，用0.85% NaCl溶液洗滌3次，并重懸于0.85% NaCl溶液中至OD600≈0.1，取150 μl的細菌懸液，接種到BIOLOG生態(tài)板(EcoPlates 1506，美國BIOLOG公司)中，用150 μl的0.85% NaCl溶液作對照，30℃下恒溫培養(yǎng). BIOLOG板的每個孔中含有不同的碳源，當細菌能利用碳源時BIOLOG板的孔中呈現(xiàn)紫色，否則，就保持無色[12]，每個菌株進行3次以上重復驗證．

1.4 附生細菌的趨化性

采用平板法檢測細菌對于葡萄糖和氨基酸的趨化性[13-14]．固體培養(yǎng)基包含1×10-2mol/L的K2HPO4、1×10-3mol/L的MgSO4、1×10-3mol/L的(NH4)2SO4、1×10-4mol/L的EDTA、3×10-5mol/L的蛋氨酸、1×10-5mol/L的D-葡萄糖和0.2%瓊脂, pH值調(diào)至7.0．收集培養(yǎng)到對數(shù)期的細菌，用0.85% NaCl 溶液連續(xù)洗滌3次，重懸細菌．將吸取10 μl重懸菌液的槍頭垂直插入固體培養(yǎng)基，菌液慢慢滲入瓊脂培養(yǎng)基中．30℃下恒溫培養(yǎng)，細菌從接種點為中心向外圓形擴散生長，以4天后檢測的圓形直徑大小來反映細菌的趨化性強弱，每種細菌重復3次實驗．

1.5 附生細菌的細胞表面疏水性

采用MATH法來測定細胞疏水性[15]，收集培養(yǎng)48 h的細菌，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH 7.0)洗滌3次并重懸于PBS中至OD600≈1.0，取4 ml洗滌后的細菌懸浮液加4 ml正十六烷于試管中渦旋混合1 min，靜置10 min，測定下層水相OD600值．

(1)

式中，ODi是初始細菌懸液的OD600值，ODf是與十六烷混合后下層水相的OD600值，每種細菌做3次重復實驗．

1.6 附生細菌的自聚和共聚能力

采用分光光度法分析細菌的自聚和共聚能力[16]．收集培養(yǎng)48 h的細菌，PBS洗滌3次并重懸細菌至OD600≈1.0，每種菌液取4 ml加入到比色皿中，室溫下靜置0、1、4和24 h后檢測細菌懸浮液的OD600值．

(2)

式中，A0是細菌懸浮液的初始OD600值，At是靜置后細菌懸浮液的OD600值．

共聚能力分析時細菌懸液的制備同上，同種微囊藻中分離得到的附生細菌每兩株一組，各取2 ml細菌懸浮液加入到同一比色皿中混勻，同時每種細菌各取4 ml分別加入到一個比色皿中作為對照，室溫靜置1、4、24 h后，檢測混合菌液和單個菌液的OD600值．

(3)

式中，Ax和Ay分別是兩種細菌在對照比色皿中的OD600值，Axy是兩種細菌混合液的OD600值．

2 實驗結(jié)果

2.1 附生細菌的分子鑒定

從4種群體微囊藻(NJ-24、NJ-54、NJ-159和NJ-177)中分離得到18株附生細菌，其中α-變形菌綱(Alphaproteobacterium)7株，β-變形菌綱(Betaproteobacterium)1株， γ-變形菌綱(Gammaproteobacterium)2株，放線菌綱(Actinobacteria)4株，纖維粘網(wǎng)菌綱(Cytophagia)2株，黃桿菌綱(Flavobacteriia)2株．從惠氏微囊藻、堅實微囊藻、水華微囊藻和銅綠微囊藻分離得到的附生細菌種類有差異，分別得到了4、6、7和8株細菌，其中α-變形菌在4種微囊藻中都存在，附生β-變形菌只存在于銅綠微囊藻．惠氏微囊藻和堅實微囊藻中未發(fā)現(xiàn)附生放線菌，水華微囊藻中未發(fā)現(xiàn)附生纖維粘網(wǎng)菌，而銅綠微囊藻中未發(fā)現(xiàn)附生黃桿菌(表1)．

2.2 附生細菌的生化特性

從18種附生細菌利用碳源的種類數(shù)(圖1)來看，僅有3株細菌(α-變形菌綱中的HJX5和HJX9，以及放線菌綱中的HJX8)只能利用5種碳源，利用碳源的范圍較窄，其他細菌利用碳源的范圍較廣，都能夠利用10種以上的碳源，有11株細菌能利用20種以上的碳源，包括5株α-變形菌(HJX3、HJX11、HJX18、HJX16和HJX15)、1株β-變形菌HJX14、2株放線菌(HJX17和HJX19)、1株纖維粘網(wǎng)菌HJX10以及2株黃桿菌(HJX1和HJX21)．從表1和圖1可以發(fā)現(xiàn)，在能夠利用20種以上的碳源的附生細菌中，惠氏微囊藻中有兩株細菌(HJX3和HJX1)， 堅實微囊藻中有4株(HJX1、HJX3、HJX10和HJX11)，水華微囊藻中有2株(HJX18和HJX21)，銅綠微囊藻中有5株(HJX16、HJX15、HJX14、HJX19和HJX17)，每種微囊藻群體中都含有2株以上代謝潛力很高(能利用20種以上碳源)的細菌. 每種微囊藻中的大多數(shù)附生細菌都能利用10種以上的碳源，也就是說，每種微囊藻中的大多數(shù)附生細菌種類都能利用較多的有機碳源．

從能夠利用每種碳源的細菌種類數(shù)(圖2)來看，六大類碳源中的碳水化合物、氨基酸、羧酸、多聚物、酚酸類和胺類均可以被附生細菌所利用．31種碳源中有21種碳源都能被10種以上細菌利用，其中利用丙酮酸甲酯的細菌數(shù)量最多，達到了17種，有5種碳源(D-半乳糖醛酸、D-半乳糖-γ-內(nèi)酯、肝糖、4-羥基苯甲酸、腐胺)能夠被5～9種細菌利用，有5種碳源(D,L-α-磷酸甘油、衣康酸、γ-羥基丁酸、2-羥基苯甲酸、苯乙基胺)只能被1～3種細菌利用，其中2-羥基苯甲酸只能被一種細菌利用．

2.3 附生細菌的趨化性和疏水性

18種附生細菌中有12種具有趨化性(表2)，六大類群的附生細菌中均存在具趨化性的種類．在具趨化性的細菌中，γ-變形菌綱的細菌HJX22趨化性最強，其趨化環(huán)直徑達到43.1 mm，α-變形菌綱細菌HJX16和HJX18以及黃桿菌綱細菌HJX1的較強，其趨化環(huán)直徑超過了20 mm，而β-變形菌綱細菌HJX14的最弱，其趨化環(huán)直徑只有4.7 mm．不具有趨化性的細菌包括3株α-變形菌(HJX5、HJX9和HJX15)、2株放線菌(HJX8和HJX20)以及1株黃桿菌(HJX21)．趨化直徑超過20 mm的附生細菌在惠氏微囊藻和堅實微囊藻中都只有1株細菌(HJX1)，水華微囊藻中有2株(HJX18和HJX22)，銅綠微囊藻中有1株(HJX16)(表1、2)．水華微囊藻的7株附生細菌中有4株不具有趨化性，惠氏微囊藻附生細菌都具有趨化性，堅實微囊藻和銅綠微囊藻附生細菌中大多數(shù)種類都具有趨化性(表3)．

18種附生細菌中有12種顯示疏水性(表2)，α-變形菌綱的細菌HJX15和放線菌綱的細菌HJX17疏水性最強，分別達到79.0%和78.4%，α-變形菌綱的細菌HJX18和放線菌綱的細菌HJX19疏水性也較強，分別為52.0%和58.5%．6種附生細菌疏水性數(shù)值都為0，表現(xiàn)出親水性，包括α-變形菌綱的細菌HJX11和HJX16、γ-變形菌綱的細菌HJX22、纖維粘網(wǎng)菌綱的細菌HJX10以及黃桿菌綱的細菌HJX1和HJX21．在惠氏微囊藻和堅實微囊藻中都沒有疏水性大于50%的附生細菌，而在水華微囊藻中有1株(HJX18)，在銅綠微囊藻中有3株(HJX15、HJX19和HJX17)(表1、2)．每種微囊藻附生細菌中的大多數(shù)種類都具有疏水性(表3)．

表1 群體微囊藻附生細菌的分子鑒定*

* -：未發(fā)現(xiàn);下劃線數(shù)據(jù)顯示的是所占比例最高的菌株；斜體字數(shù)據(jù)顯示的是所占比例最低的菌株．

圖1 每個細菌在BIOLOG板上利用碳源的數(shù)量Fig.1 The number of carbon sources utilized by each bacterial isolate in the BIOLOG system

圖2 能夠利用BIOLOG板上每種碳源的細菌數(shù)Fig.2 The number of bacterial isolates capable of utilizing each carbon source in the BIOLOG system

2.4 附生細菌的聚集特性

在自聚實驗過程中肉眼觀察到14種附生細菌懸浮液中具有細菌聚集后下沉的現(xiàn)象，顯示具有自聚能力(表2)．α-變形菌綱中的細菌HJX5和HJX9自聚能力最強，靜置1 h后就分別達到了50.8%和48.0%，在靜置4 h和24 h的自聚能力也都高于其他細菌. α-變形菌綱的細菌HJX16、放線菌綱的細菌HJX8和纖維粘網(wǎng)菌綱的細菌HJX10自聚能力也較強，靜置24 h后都達到了45%以上．在實驗過程中，α-變形菌綱的細菌HJX3、γ-變形菌綱的細菌HJX22、纖維粘網(wǎng)菌綱的細菌HJX4和黃桿菌綱的細菌HJX1沒有觀察到細菌聚集現(xiàn)象，不具有自聚能力．在惠氏微囊藻中沒有24 h自聚能力超過40%的附生細菌，在堅實微囊藻中有1株(HJX10)，水華微囊藻中有3株(HJX5、HJX9和HJX8)，銅綠微囊藻中有1株(HJX16)(表1、2)．惠氏微囊藻的4株附生細菌只有1株具有自聚能力，而堅實微囊藻、水華微囊藻和銅綠微囊藻附生細菌中的大多數(shù)種類都具有自聚能力(表3)．

表2 細菌的趨化性、疏水性與自聚能力*

*數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，n= 3； -表示在24 h的實驗過程中沒有觀察到比色皿中有細菌聚集的現(xiàn)象．

表3 4種微囊藻中附生細菌特性的比較分析

共聚分析實驗發(fā)現(xiàn)共計有9組細菌表現(xiàn)出共聚能力(表4)，其他組合未發(fā)現(xiàn)有共聚能力，每種微囊藻都至少包含一組細菌具有自聚能力．來自水華微囊藻的兩組細菌HJX18和HJX5以及HJX9和HJX5顯示了最高的共聚能力，靜置4 h后分別達到了42.3%和39.4%．

3 討論

3.1 附生細菌的組成和生化特性

自然界中附生細菌附著于微囊藻群體生長，其營養(yǎng)來源除了藻細胞產(chǎn)生的有機物以外，還可能包含水中的其他有機物．本研究從實驗室培養(yǎng)的微囊藻群體中分離得到的附生細菌生長完全依賴于藻細胞產(chǎn)生的有機物，避免了自然環(huán)境中其他來源有機物的干擾．

分離得到的18株細菌中有10株屬于變形菌門，而且4種微囊藻的附生細菌群中都包含變形菌，這與已經(jīng)報道的野外生長的微囊藻群體附生細菌群中變形菌占優(yōu)勢是一致的[4-6]．除了變形菌以外，本研究中還分離得到了放線菌綱、纖維粘網(wǎng)菌綱和黃桿菌綱的細菌，以前的報道也顯示微囊藻群體附生細菌群中包含這些細菌[4-7]．纖維粘網(wǎng)菌綱和黃桿菌綱細菌被認為可能參與了微囊藻產(chǎn)生的高分子化合物的降解[7]．附生細菌HJX9是鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)，Park等報道鞘氨醇單胞菌能夠降解微囊藻毒素[17]．附生細菌HJX22是假單胞菌(Pseudomonassp.)，有報道顯示假單胞菌與微囊藻細胞之間有磷的轉(zhuǎn)移，被認為是微囊藻生長的磷庫[18]．

表4 附生細菌的共聚能力*

*數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，n=3.

BIOLOG板分析顯示，18種附生細菌中有15種細菌利用碳源的范圍較廣，能夠利用10種以上碳源，BIOLOG 板中的碳水化合物、氨基酸、羧酸、多聚物、酚酸類、胺類六大類碳源都能被附生細菌所利用，31種碳源中有21種碳源都能被10種及以上細菌利用. 這說明群體微囊藻的附生細菌群代謝旺盛，具有利用藻細胞產(chǎn)生的各類化合物的潛力．

3.2 附生細菌的趨化性、細胞疏水性和聚集特性及其對細菌附著能力的影響

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有對氨基酸的趨化性，這有利于其與魚腥藻(Anabaenasp.)建立共生關系[19]．研究發(fā)現(xiàn)18種附生細菌中有12種具有趨化性，這一特性有利于附生細菌在微囊藻群體上的附著生長．Prasad等研究發(fā)現(xiàn)，北極藍藻附生細菌群中也包含一些不具有趨化性的種類[14]，18種附生細菌中也包含6種不具有趨化性的細菌，這說明雖然趨化性有利于細菌與藍藻建立附生關系，但是藍藻附生細菌群中也會包含不具有趨化性的細菌．

細胞表面疏水性是反映細菌粘附能力的一個指標[2], 自聚是指遺傳特性相同的同種細菌之間的相互粘附，而共聚是指遺傳特性不同的不同種細菌之間的粘附[20]．細菌的疏水性、自聚能力和共聚能力都有利于細菌聚集形成群體以及粘附于生物和非生物界面[20-21]. 微囊藻群體是由藻細胞和更多的細菌聚集形成的，細菌數(shù)量與藻細胞的數(shù)量比率為10～50[3]．細胞疏水性已經(jīng)被證明在微囊藻細胞粘附而形成群體過程中發(fā)揮了重要作用[2]．分離得到的18種細菌中有12種細菌顯示疏水性，14種細菌顯示自聚能力，每種微囊藻中也至少有一組細菌表現(xiàn)出共聚能力，這顯示附生細菌的疏水性、自聚能力和共聚能力在細菌參與微囊藻群體形成過程中可能發(fā)揮了作用．

Shi等的研究發(fā)現(xiàn)微囊藻附生細菌群組成不同于水中的游離菌群[4]，這說明細菌會有選擇性地附生于微囊藻群體．細菌的旺盛代謝潛力、趨化性、疏水性、自聚能力和共聚能力可能有利于附生細菌定殖于微囊藻群體．3株細菌(HJX5、HJX9和HJX8)利用有機物種類最少，也不具有趨化性，這兩個方面不利于其附著生長，但是這3株細菌都具有最高的自聚能力，高自聚能力有利于附著生長．此外，6株細菌(HJX5、HJX9、HJX15、HJX8、HJX20和HJX21)不具有趨化性，6株細菌(HJX11、HJX16、HJX22、HJX10、HJX1和HJX21)都是親水性的，而4株細菌(HJX3、HJX22、HJX4和HJX1)都不具有自聚能力，這些方面都不利于細菌附著生長．但是，在趨化性、疏水性和自聚能力方面所有這些細菌都至少有一個方面的數(shù)值是不為0的，也就是說，這些細菌至少擁有一個有利于附著生長的特性．

4株細菌(HJX3、HJX5、HJX14和HJX4)是所占比例最低的細菌(表1)，細菌HJX3和HJX4的自聚能力為0，細菌HJX5不具趨化性而且只能利用很少種類的有機碳源，細菌HJX14的趨化性能很低，這些方面應該是導致這4株細菌比例低的部分因素．3株細菌(HJX18、HJX15和HJX2)是所占比例最高的細菌(表1)，3株細菌都能利用較多種類的有機碳源，細菌HJX15具有最高的疏水性，細菌HJX18和HJX2的趨化性、疏水性和自聚能力都不為0，這些方面應該是導致這3株細菌比例高的部分因素．

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Characterization of epiphytic bacteria associated with colonialMicrocystis

FAN Qi, XIAO Huijie, WU Qiang, WANG Shuijuan & LI Pengfu**

(SchoolofLifeSciences,NanjingUniversity,Nanjing210093,P.R.China)

Epiphytic bacteria associated with colonialMicrocystismay play an important role in the development of cyanobacterial bloom. However, information on characterization ofMicrocystis-associated bacteria is limited. In this study, eighteenMicrocystis-associated bacteria which belonged to six bacterial groups:Alphaproteobacterium,Betaproteobacterium,Gammaproteobacterium,Actinobacteria,CytophagiaandFlavobacteriia, were isolated from fourMicrocystisspecies (M.wesenbergii,M.flos-aquae,M.firmaandM.aeruginosa). Analysis by BIOLOG plate indicated that except for two isolates ofAlphaproteobacteriumand one isolate ofActinobacteria, the other isolates were capable of utilizing more than 10 carbon sources. Among 18 bacterial isolates, 12 isolates showed chemotaxis, 12 isolates displayed hydrophobicity, and 14 isolates exhibited autoaggregation ability. Except forFlavobacteriia, other five groups contained hydrophobic bacterial isolates. All six groups contained bacterial isolates with chemotaxis and autoaggregation ability. Most of bacterial isolates associated with eachMicrocystisspecies were capable of utilizing more than 10 carbon sources, and exhibited hydrophobicity. For eachMicrocystisspecies, there was at least one group of bacterial isolates exhibiting coaggregation ability. Except forM.flos-aquae, most of bacterial isolates associated with each of other threeMicrocystisspecies showed chemotaxis. The results indicated that active metabolic potential, chemotaxis, hydrophobicity, and the abilities of autoaggregation and coaggregation might help the bacteria colonize theMicrocystiscolonies.

Microcystis; epiphytic bacteria; diversity; characteristic

*國家自然科學基金項目(31270447)和國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973”項目(2008CB418004)聯(lián)合資助. 2016-07-06收稿；2016-09-07收修改稿. 范琦(1993～), 女，碩士研究生；E-mail: fanqi1993@yahoo.com.

；E-mail: pengfuli@nju.edu.cn.