不同品系小鼠腹腔巨噬細胞對LPS的反應性初步比較研究

陳 偉， 馬 瑞， 張騰騰， 張 涵， 李艷茹， 李太元

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

不同品系小鼠腹腔巨噬細胞對LPS的反應性初步比較研究

陳 偉， 馬 瑞， 張騰騰， 張 涵， 李艷茹， 李太元*

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

為初步探究不同品系小鼠腹腔巨噬細胞對LPS的反應性區(qū)別，通過對C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠和昆明小鼠腹腔注射硫乙醇酸鹽(Thioglycollate，TG)以誘導巨噬細胞聚集。4 d后收集細胞，計數(shù)并培養(yǎng)。使用脂多糖(LPS)分別刺激3種細胞，測定并對比炎癥因子的分泌情況。結(jié)果表明:腹腔注射TG后，C57BL/6小鼠誘導率最高；LPS刺激細胞后，C57BL/6小鼠的腹腔巨噬細胞分泌的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2的分泌量均較其他2種小鼠高。

硫乙醇酸鹽；腹腔巨噬細胞；炎癥因子；C57BL/6小鼠；BALB/C小鼠；昆明鼠

炎癥(inflammation)是機體在組織損傷或試圖對抗?jié)撛诘挠泻Υ碳r發(fā)生的一種自身防御性反應，通常情況下對機體是有利的，但過度的炎癥反應則會導致機體釋放過多的炎性介質(zhì)，導致局部或全身的炎癥性疾病，引起2次病理損傷，如類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、哮喘、肺纖維化等[1-3]。

巨噬細胞(macrophages)源于體內(nèi)的單核細胞，主要功能為吞噬異物(如細胞殘片、病原體)和激活其他免疫細胞。當機體受到病原體的攻擊時，會誘導巨噬細胞活化并向感染部位募集，并引起炎癥反應[4-6]。因此，巨噬細胞的數(shù)量在一定程度上反映了炎性反應強度。

隨著體外分離培養(yǎng)細胞技術(shù)的發(fā)展,巨噬細胞的提取方法有多種,細胞來源有豬、兔、大鼠、小鼠等。但由于研究目的不同,在體內(nèi)提取細胞的部位也各不相同,如提取肺血管巨噬細胞、腎小球巨噬細胞,骨髓基質(zhì)巨噬細胞、腹腔巨噬細胞等[7]。通過提取腹腔巨噬細胞，建立穩(wěn)定的原代細胞模型對實驗研究具有重大意義[8-9]，但目前對不同品系小鼠腹腔提取的巨噬細胞對LPS引發(fā)的炎癥相關因子的差異尚無報道。本研究選擇3種不同品系小鼠，通過腹腔注射TG溶液形成無菌性炎癥[10]，隨后收集腹腔巨噬細胞，進行功能檢測，從而比較不同品系小鼠腹腔巨噬細胞募集數(shù)量及炎癥相關指標的差異，為體外細胞模型的建立提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雌性昆明小鼠，8周齡，購自延邊大學實驗動物中心；雌性BALB/c 小鼠、雌性C57BL/6 小鼠，8周齡，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司。飼喂于標準飲食，充足水源，保持12 h 晝夜交替環(huán)境下。

1.1.2 試劑

硫乙醇酸鹽(Thioglycollate，TG)，購自上海碧迪醫(yī)療器械公司；脂多糖(LPS)、ATP，購自Sigma公司；ELISA試劑盒，購自BD公司；胎牛血清(FBS)、抗生素、DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司。iNOS抗體、COX-2抗體，購自Santa Cruz生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TG制備

稱取20 g TG固體顆粒，溶于少量蒸餾水中，充分溶解后煮沸30 min，室溫冷卻后定容至500 mL，在121 ℃條件下滅菌15 min后，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細胞的誘導及收集

取不同品系的8周齡小鼠，每只小鼠腹腔注射3 mL TG溶液后，正常飼養(yǎng)。4 d后處死小鼠，無菌條件下抽取5 mL 預冷PBS緩沖液灌洗腹腔，回收腹腔細胞懸液[11]。臺盼藍染色進行細胞計數(shù)，使用DMEM細胞培養(yǎng)液(含10% FBS)將細胞過夜培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2條件下。

1.2.3 一氧化氮濃度檢測

將腹腔巨噬細胞接種于48孔板中，根據(jù)處理時間將3種細胞分別分為空白組和LPS(100 ng/mL)處理12、18、24 h 3組。收集細胞上清液，按1∶1比例加入Griess試劑，使用酶標儀在550 nm波長處測定OD值。根據(jù)一氧化氮標準液制作標準曲線，并計算一氧化氮濃度。

1.2.4 TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度檢測

將腹腔巨噬細胞接種于48孔板中，并分為空白組、TNF-α、IL-6和IL-1β 4組。其中，TNF-α和IL-6組分別加入LPS(100 ng/mL)處理4 h；IL-1β組先加LPS處理3 h后，替換無FBS的Opti-MEM后，加入ATP(5 mmol/L)處理1 h。收集細胞上清液，參照ELISA試劑盒方法處理，使用酶標儀在450 nm波長處測定OD值。根據(jù)TNF-α、IL-6和IL-1β標準液作出標準曲線，計算TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度。

1.2.5 iNOS和COX-2分泌量檢測

將腹腔巨噬細胞接種于6孔板，并分為空白組和LPS(100 ng/mL)處理組。處理24 h后棄上清，使用RIPA裂解液裂解細胞。將裂解液在15 000 r/min離心15 min，獲取上清液，蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。經(jīng)脫脂奶封閉后，用iNOS和COX-2抗體孵育過夜。使用ECL化學發(fā)光法檢測iNOS和COX-2的分泌量。

1.2.6 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 5進行t-檢驗統(tǒng)計學分析，采用雙尾分布，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著性差異，P<0.001表示具有極其顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹腔巨噬細胞的誘導率比較

腹腔注射TG 4 d后，3種品系小鼠巨噬細胞均被募集至腹腔。

由圖1可知，C57BL/6小鼠誘導率最高，為3.3×107cells，較BALB/c小鼠和昆明鼠均有極其明顯差異。

***表示C57BL/6與BALB/C和昆明鼠相比P<0.001

2.2 一氧化氮的產(chǎn)生量比較

為了驗證3種小鼠巨噬細胞經(jīng)LPS誘導后，其細胞炎癥反應是否具有差異。將3種小鼠腹腔巨噬細胞分別使用LPS預處理不同時間段后，檢測其NO產(chǎn)量。由圖2可知，LPS刺激后3種小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO的含量具有一定的時間依賴性，即處理時間越長，NO產(chǎn)量越高。其中，18 h處理組中，C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞的NO產(chǎn)量較其他2種小鼠呈明顯差異，24 h處理組，則呈極其顯著差異。

***表示C57BL/6與BALB/C和昆明鼠相比P<0.001

圖2 LPS誘導后3種品系小鼠一氧化氮產(chǎn)量

Fig.2 The production of nitric oxide after LPS induction in three strains of mice

2.3 小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子分泌量比較

為更進一步了解3種小鼠腹腔巨噬細胞對炎癥相關因子表達是否具有差異,檢測了TNF-α、IL-6、IL-1β以及iNOS和COX-2的表達。由圖3可知，LPS刺激后，C57BL/6小鼠IL-1β分泌量低于其他2種小鼠。而BALB/C小鼠與C57BL/6小鼠TNF-α及IL-6分泌量無明顯差異，但均高于昆明鼠且差異顯著。在相關炎癥信號通路中，C57BL/6小鼠iNOS和COX-2的表達水平明顯強于其他2種小鼠。

圖3 LPS誘導后炎癥因子分泌量測定

3 討論與結(jié)論

巨噬細胞作為一種非常重要的免疫細胞，其在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用不言而喻。先前研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞多游離于腹水中，容易獲得，因此在許多實驗室中要進行藥物的抗炎機制研究時，往往選用小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象[12-13]。而獲得數(shù)量多、純度高的原代巨噬細胞，則是建立穩(wěn)定、標準的體外模型的基礎。目前國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種方法可以分離出小鼠腹腔巨噬細胞，采用預先注入巨噬細胞誘導劑，以誘導大量的巨噬細胞聚集到腹腔，通過灌洗腹腔獲得大量腹腔巨噬細胞[14]。TG作為一種肉湯培養(yǎng)基，不僅能夠培養(yǎng)厭氧微生物，使其生長良好，還能通過腹腔注射，引起非感染性炎癥刺激，促進巨噬細胞聚集到腹腔中[2,10]。本試驗選用C57BL/6、BALB/C和昆明鼠3種不同品系的小鼠，使用TG作為誘導劑募集巨噬細胞，從而獲得大量的腹腔巨噬細胞。通過比對誘導率發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠的誘導率最高，達3.3×107cells/只。并且由C57BL/6小鼠獲得的巨噬細胞數(shù)目穩(wěn)定，較其他2種小鼠種間差異性小。

脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，也是炎癥刺激因子的一種。巨噬細胞經(jīng)過 LPS刺激后，MyD88和TRIF信號通路調(diào)控的MAPK級聯(lián)反應被激活，進而激活下游核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-κB亞基P50和P65進入細胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，促進誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α等mRNA表達，生成相應炎癥介質(zhì)[15-16]。巨噬細胞內(nèi)存在的iNOS被LPS誘導產(chǎn)生并產(chǎn)生NO，起到殺傷多種病原體及腫瘤細胞的作用，參與巨噬細胞的非接觸性細胞殺傷過程[17-18]。通過對3種小鼠腹腔巨噬細胞預處理不同時間段LPS發(fā)現(xiàn)，其NO生成量均隨時間增加呈梯度上升，且相同時間下C57BL/6小鼠產(chǎn)生NO的量遠高于C57BL/6小鼠和昆明鼠。通過比較細胞因子及炎癥信號因子分泌量發(fā)現(xiàn)，雖然C57BL/6小鼠IL-1β的分泌量與其他2種小鼠相比較低，但TNF-α、IL-6的水平以及其在核內(nèi)信號通路中iNOS和COX-2的表達水平均比其他2種小鼠高。

綜上所述，C57BL/6小鼠在炎癥相關因子及細胞信號通路表達上，整體呈現(xiàn)較高水平。該試驗通過對3種品系小鼠巨噬細胞進行對比，篩選出較適合進行炎癥相關體外試驗的原代巨噬細胞，為后期的實驗研究提供一定的理論依據(jù)。

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Preliminary comparative study of LPS reactivity on the peritoneal macrophages from different strains of mice

CHEN Wei, MA Rui, ZHANG Tengteng, ZHANG Han, LI Yanru, LI Taiyuan*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In order to explore the difference of the responses of LPS-induced macrophages from different strains of mice, we injected thioglycollate (TG) into C57BL/6 mice, BALB/C mice and Kunming mice intraperitoneally to induce macrophage aggregation. After 4 days, the cells were collected, counted and cultured. We used lipopolysaccharide (LPS) to stimulated three cells respectively, then measured and compared the secretion of inflammatory cytokines. The results showed that C57BL/6 mice had the highest induction rate after induced by TG. After LPS stimulation, the secretions of TNF-α, IL-6, iNOS and COX-2 from peritoneal macrophages of C57BL/6 mice were higher than the other two strains of mice.

Thioglycollate; peritoneal macrophages; inflammatory cytokines; C57BL/6 mice; BALB/C mice；Kunming mice

2017-01-07

陳偉(1989—)，男，陜西咸陽人，在讀碩士，研究方向為動物微生物與免疫學。李太元為通信作者，E-mail:tyli@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0079-04

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.014

R459.7

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