豬附紅細(xì)胞體吉林感染株二維電泳圖譜分析

叢艷昭， 倪婷婷， 伍生軍， 齊 楷， 薛書江*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院;2.吉林省延吉市動(dòng)物衛(wèi)生檢疫站；3.吉林省延邊州畜牧總站：吉林 延吉 133000)

豬附紅細(xì)胞體吉林感染株二維電泳圖譜分析

叢艷昭1,2， 倪婷婷1， 伍生軍1， 齊 楷3， 薛書江1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院;2.吉林省延吉市動(dòng)物衛(wèi)生檢疫站；3.吉林省延邊州畜牧總站：吉林 延吉 133000)

為獲得豬附紅細(xì)胞體吉林感染株2-DE圖譜,并篩選豬附紅細(xì)胞體吉林感染株免疫原性蛋白，本試驗(yàn)采用2-D電泳分析豬附紅細(xì)胞體蛋白表達(dá)譜，利用感染血清與二維電泳凝膠進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果表明：二維電泳共檢測到(60±5)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，蛋白主要集中在pH值6～9和分子量45～25 ku。二維電泳中的9個(gè)蛋白點(diǎn)被豬附紅細(xì)胞體感染血清所識(shí)別。本研究將為進(jìn)一步開展豬附紅細(xì)胞體病的疫苗和診斷候選分子研究奠定基礎(chǔ)。

豬附紅細(xì)胞體；吉林感染株；蛋白組學(xué)；2-DE圖譜

豬附紅細(xì)胞體是附著于豬紅細(xì)胞表面的細(xì)胞外病原，可引起紅細(xì)胞損傷和畸形。豬附紅細(xì)胞體病急性臨床癥狀為發(fā)熱、急性貧血和低發(fā)病率、高死亡率的黃疸。慢性病例可引起母豬的繁殖效率降低，育肥豬生長遲緩，呼吸道和腸道疾病的發(fā)病率增加[1-5]。該病對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。

所有生命現(xiàn)象的體現(xiàn)者和直接參與者是蛋白質(zhì)。所以，只有通過對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行整體、動(dòng)態(tài)和網(wǎng)絡(luò)水平上的分析，才能全面和深入地認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)。在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)誕生之前，對(duì)生命現(xiàn)象的研究往往僅針對(duì)某個(gè)單一蛋白，而蛋白質(zhì)組學(xué)是從一個(gè)網(wǎng)絡(luò)水平上來揭示蛋白質(zhì)信號(hào)系統(tǒng)。大規(guī)模、高通量和整體蛋白質(zhì)水平是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究特點(diǎn)，因此，蛋白質(zhì)組學(xué)成為當(dāng)前開發(fā)疫苗、藥物和了解病原微生物生長、發(fā)育的有效手段，并在病原微生物研究中展現(xiàn)了無限的應(yīng)用前景[6,7]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)于豬附紅細(xì)胞體病的研究也是一種有效、必要的工具。本研究對(duì)解離的豬附紅細(xì)胞體吉林感染株進(jìn)行了蛋白組學(xué)二維電泳圖譜分析和二維電泳凝膠的免疫印跡分析。旨在篩選豬附紅細(xì)胞體免疫原性蛋白，為豬附紅細(xì)胞體病的診斷和防治研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

豬淋巴細(xì)胞分離液、1.2 μm濾膜、CHAPS、二硫蘇糖醇、Tris、TEMED、SDS和TCA等購自寶生物工程(大連)有限公司；13 cm pH值3～10梯度膠條、2-D Clean-up kit為GE公司產(chǎn)品。

1.2 陽性血液的鑒定

豬附紅細(xì)胞體吉林感染株陽性血液的鑒定參照薛書江[8]的方法進(jìn)行。

1.3 樣本和感染血清的制備

1.3.1 樣本的制備

將鑒定為陽性的抗凝血洗滌、白細(xì)胞去除、水浴、濾過和離心，收集病原體。超聲裂解后12 000 r/min離心30 min。上清液移至新的離心管中，加入TCA，使終濃度達(dá)到10%。去上清，用預(yù)冷丙酮洗2次，沉淀干燥5 min。加入IPG Buffer溶解沉淀，室溫離心5 min，保留上清。樣本在水化前用2-D Clean-up試劑盒純化。

1.3.2 感染血清的制備

參照郭蓮娣的方法[9-10]，略有改進(jìn)。PCR檢測確認(rèn)小鼠未被豬附紅細(xì)胞體感染。用豬附紅細(xì)胞體檢測呈陽性的血液腹腔接種給小鼠，之后采集小鼠血液，經(jīng)血涂片染色和PCR檢測豬附紅細(xì)胞體。確認(rèn)小白鼠被感染后，采集血液，制備血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 水化

取水化盤，添加280 μL制備好的蛋白樣品。干膠條去掉保護(hù)膜后放入水化盤，膠面向下。膠條表面用1～2 mL礦物油完全覆蓋，樣品室溫靜置水化14～15 h。

1.5 蛋白樣本的等電聚焦電泳

干膠條水化完成后放入聚焦槽中。鋪設(shè)鹽橋，按以下程序電泳：電壓500 V,2 h；電壓1 000 V,1 h；電壓8 000 V,2.5 h；電壓8 000 V,0.5 h。

1.6 蛋白樣本的平衡

聚焦完成的膠條轉(zhuǎn)移至平衡液Ⅰ[0.375 mol/L Tris-HCl(pH值8.8)、6 mol/L尿素、2% SDS、20%甘油、20 g/L DTT]中平衡15 min，再轉(zhuǎn)移至平衡液Ⅱ[0.375 mol/L Tris-HCl(pH值8.8)、6 mol/L尿素、2% SDS、20%甘油、25 g/L IAA]中平衡15 min。將膠條上殘留的平衡液用高純度水洗凈。

1.7 蛋白樣本的SDS-PAGE電泳

膠條平衡后，放置于預(yù)先配置好的12% SDS-PAGE凝膠頂部，不要產(chǎn)生氣泡。最后，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂，然后將其放置到電泳槽內(nèi)。電泳電壓設(shè)置：起始為50 V，而后，適當(dāng)增加電壓。電泳完畢后，取出凝膠，切角進(jìn)行標(biāo)記。兩板凝膠一板進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，另一板進(jìn)行免疫印跡。

1.8 凝膠的染色及脫色

將凝膠取出后置于先前配置好的固定液中處理40 min。考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，然后脫色，直至凝膠上的蛋白點(diǎn)明顯可視。

1.9 免疫印跡

在染色前對(duì)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將轉(zhuǎn)印有標(biāo)準(zhǔn)蛋白的膜切下，浸入到氨基黑染色液中染色，然后脫色。另一部分膜，依次進(jìn)行一抗(豬附紅細(xì)胞體感染血清)反應(yīng)，酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG )反應(yīng)，然后進(jìn)行底物顯色，最后進(jìn)行圖像掃描。

1.10 圖像的采集

用掃描儀將脫色至背景清晰的二維電泳凝膠掃描。掃描儀按如下設(shè)置：透射掃描模式，光學(xué)分辨率400 dpi。用保鮮膜將掃描后的凝膠包裹，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 圖像分析

將2-DE凝膠掃描圖像和免疫印跡的掃描圖像進(jìn)行對(duì)比分析。根據(jù)所用干膠條的pH值和預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的位置，分別確定蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和分子量大小。標(biāo)記并記錄感染血清識(shí)別的蛋白質(zhì)點(diǎn)在2-DE凝膠上的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬附紅細(xì)胞體陽性血液的鑒定

無菌采集抗凝血，制作血涂片。經(jīng)吖啶橙染色和姬姆薩氏染色后的血涂片，鏡檢可見豬附紅細(xì)胞體感染(圖1，2)。圖1可見血液涂片背景較清晰，紅細(xì)胞呈淡綠色, 附紅細(xì)胞體呈現(xiàn)橘紅色熒光和綠色熒光2種，很容易分辨，且多為單體存在。部分血漿中呈游離狀態(tài)的附紅細(xì)胞體也可觀察到熒光。由圖2可見，紅細(xì)胞呈淡紅色，且紅細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變形，呈齒輪狀。附紅細(xì)胞體吸附在紅細(xì)胞表面，被染為藍(lán)紫色。

圖1 豬附紅細(xì)胞體吖啶橙染色(1 000×)

圖2 豬附紅細(xì)胞體吉姆薩氏染色(1 000×)

2.2 豬附紅細(xì)胞體2-DE圖譜

反復(fù)優(yōu)化電泳條件的結(jié)果顯示，應(yīng)用13 cm、pH值3～10 的IPG 膠條、850 μg蛋白上樣量、考馬氏亮藍(lán)染色，獲得了較理想的豬附紅細(xì)胞體雙向電泳圖譜(圖3)。

由圖3可見，共有(60±5)個(gè)蛋白斑點(diǎn)在豬附紅細(xì)胞體蛋白組2-DE圖譜中被檢測到，而且大部分集中在pI 6～9范圍內(nèi)。檢測到的蛋白斑點(diǎn)大部分分布在偏弱堿性區(qū)域(pH值6～9)，分子量分布在66～15 ku，集中分布在45～25 ku。圖譜顯示，蛋白斑點(diǎn)可見度高、數(shù)量較多、分辨率高，凝膠背景染色淺。重復(fù)檢測結(jié)果顯示，斑點(diǎn)分布模式近乎相同，表現(xiàn)為形態(tài)大小存在差異以及分布無規(guī)律、顏色深淺不一。

圖3 豬附紅細(xì)胞體2-DE圖譜

2.3 豬附紅細(xì)胞體吉林感染株免疫原性蛋白的篩選

未經(jīng)染色的2-DE凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)印,用豬附紅細(xì)胞體感染血清作為一抗，識(shí)別豬附紅細(xì)胞體全病原體蛋白。

由圖4A可知，豬附紅細(xì)胞體感染血清識(shí)別2-DE凝膠中的9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

由圖4B可知，通過對(duì)豬附紅細(xì)胞體蛋白的2-DE凝膠掃描圖像和免疫印跡的掃描圖像反復(fù)對(duì)比分析，在2-DE凝膠上找到了感染血清識(shí)別的共9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，標(biāo)記為1～9。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A：豬附紅細(xì)胞體感染血清識(shí)別蛋白的免疫印跡；B：血清篩選的蛋白在2-DE凝膠中對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)；1～9：血清篩選的蛋白質(zhì)點(diǎn)

圖4 豬附紅細(xì)胞體吉林感染株免疫原性蛋白的篩選結(jié)果

Fig.4 Screening results of immunogenicity protein ofM.suisin Jilin strain

3 討論與結(jié)論

蛋白樣品的制備直接影響二維電泳的成功與否，是雙向電泳中最關(guān)鍵的一步。制備抗原的過程中盡可能抽提總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失。另外，要注意提高蛋白樣品的溶解度，減少蛋白質(zhì)的人為修飾。在提取蛋白質(zhì)的過程中，注意要排除無機(jī)鹽小分子和核酸等大分子對(duì)蛋白質(zhì)可溶性和二維電泳重復(fù)性的干擾。核酸等大分子能堵塞凝膠孔徑，而無機(jī)鹽小分子濃度過高會(huì)使等電聚焦的電壓降低，甚至破壞IPG 膠條，最終都會(huì)導(dǎo)致2-D電泳的失敗。本研究將收集的豬附紅細(xì)胞體超聲波裂解后，經(jīng)TCA、冷丙酮和IPG Buffer處理，2-D Clean-up試劑盒純化，獲得了較理想的蛋白樣本。

膠條的長度、pH值范圍及凝膠染色方法等影響因素決定其樣品添加量，而樣品添加量對(duì)雙向電泳效果產(chǎn)生重要影響。蛋白加樣量過低，很難區(qū)別蛋白斑點(diǎn)或無法顯示。而蛋白加樣量過多，則會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)點(diǎn)拖尾、重疊的現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。另外，染色方法也是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素?？捡R斯亮藍(lán)染色和銀染是二維電泳常用的2種染色方法?？捡R斯亮藍(lán)染色的優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)斑點(diǎn)染色清晰，凝膠背景淺，可獲得高質(zhì)量圖譜。缺點(diǎn)是分辨率不如銀染法。銀染的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，蛋白質(zhì)點(diǎn)染色清晰。缺點(diǎn)是高豐度蛋白容易干擾低豐度蛋白的顯現(xiàn)，容易形成“空泡”，影響軟件的識(shí)別和分析。本研究通過反復(fù)優(yōu)化電泳條件，應(yīng)用13 cm、pH值3～10 的IPG 膠條、850 μg蛋白上樣量、考馬氏亮藍(lán)染色，獲得了較好效果的蛋白圖譜。

Hoelzle等[11]對(duì)人工感染豬附紅細(xì)體的豬血液中分離了病原,并進(jìn)行了二維電泳分析。結(jié)果得到了29個(gè)蛋白點(diǎn)，應(yīng)用豬附紅細(xì)體感染的豬抗血清檢測到了11個(gè)免疫反應(yīng)斑點(diǎn)。而本研究共檢測到蛋白斑點(diǎn)(60±5)個(gè)，且多數(shù)斑點(diǎn)集中在偏弱堿性區(qū)域(pH值6～9)；蛋白質(zhì)的分子量分主要集中在45～25 ku。豬附紅細(xì)胞體感染血清識(shí)別了2-DE凝膠中的9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。本研究的結(jié)果與Hoelzle等報(bào)道的有些差異，分析原因可能有2個(gè)方面：1) 由于病原體的地域差異；2) 二維電泳試驗(yàn)方法本身的性質(zhì)決定，每次試驗(yàn)結(jié)果均存在一定差異。關(guān)于豬附紅細(xì)胞體感染血清識(shí)別的蛋白的生物學(xué)活性和功能,還需在后續(xù)的試驗(yàn)研究中進(jìn)一步挖掘。

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Analysis of two-dimensional electrophoresis map forMycoplasmasuisin Jilin strain

CONG Yanzhao1,2， NI Tingting1， WU Shengjun1， QI Kai3， XUE Shujiang1*

(1.AgriculturalcollogeofYanbianUniversity; 2.AnimalHealthandQuarantineStationofYanji;3.YanbianAnimalDiseasePreventionandControlCenterofJilinProvince,YanjiJilin131100,China)

In order to obtain the 2-DE map ofMycoplasmasuisin Jilin strain and screen the immunogenic protein ofMycoplasmasuis, the protein expression profile ofMycoplasmasuiswas analyzed by 2-D electrophoresis, immunoblotting was performed with infected sera and two-dimensional gel electrophoresis.The results indicated that 60±5 protein spots were detected by two-dimensional electrophoresis,the proteins were mainly concentrated in the range of molecular weight 45 ～25 ku and pH 6～9.The 9 spots in the two-dimensional electrophoresis were identified by infected sera ofMycoplasmasuis.This study would lay the foundation for the further study ofMycoplasmasuisin swine and the candidate molecules of vaccine.

Mycoplasmasuis; Jilin strain; proteomics; 2-DE map

2017-01-10 基金項(xiàng)目：國家自然基金項(xiàng)目(31460657)；吉林省科技廳青年科研基金項(xiàng)目(20150520129JH)

叢艷昭(1982—)，男，吉林扶余人,獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物寄生蟲。薛書江為通信作者，E-mail：sjxue@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0061-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.010

S858.28

A