春蘭與大花蕙蘭雜交種原球莖增殖研究

李玉萍+羅鳳霞+史慧梅

摘要：以春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種子萌發(fā)所得的原球莖為材料，采用N6、KC、1/2MS等3種基本培養(yǎng)基配合以6-BA、KT和NAA的不同濃度設計正交試驗，篩選雜交種原球莖增殖的適宜培養(yǎng)基。結果表明：基本培養(yǎng)基是影響雜種后代原球莖增殖的首要因素，N6增殖效果最好；3種外源激素對原球莖的增殖率影響都極顯著，影響由大到小順序為NAA>KT>6-BA，NAA與6-BA濃度為1：5或1：15的比例，對原球莖增殖效果最好；春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種原球莖增殖最適宜培養(yǎng)基為N6+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA或N6+0.1 mg/L NAA+0.1mg/L KT+1.5 mg/L 6-BA。

關鍵詞：春蘭；大花蕙蘭；原球莖；增殖

中圖分類號：S682.310.3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2016）01-0053-03

雜交育種是蘭花育種最重要的方法，利用該方法已培育出10萬多個洋蘭新品種。春蘭（Cymbidium goeringii）為蘭屬多年生常綠地生草本，花單生，少數2朵，花葶直立，花小，直徑4～5 cm，花為淺黃綠色、綠白色、黃白色，香濃。春蘭高雅幽香，具有很高的觀賞價值，在我國栽培已有2000多年。大花蕙蘭（Cymbidium hybridium）是以蘭屬中的一些附生性較強的大花種為親本獲得的人工雜交種，是對蘭屬中通過人工雜交培育出的色澤艷麗、花朵碩大的品種的一個統(tǒng)稱。全世界蘭屬植物近70種，中國約49種，目前用來作雜交親本的原生種有近20種，主要是大花的附生類以及少量的地生類。蘭屬植物的果實為蒴果，其形狀、大小常因親本或原生種不同而有較大的差異。但其種子均十分細小，種子內的胚通常發(fā)育不完全，且?guī)缀鯚o胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)，現(xiàn)代育種多采用離體胚培養(yǎng)。大量擴繁的有利階段是原球莖的增殖期，本試驗采用多因素正交試驗，從基本培養(yǎng)基以及外源激素種類及其濃度探討了春蘭與大花蕙蘭雜種原球莖增殖的培養(yǎng)基，旨在為春蘭與芳香型大花蕙蘭雜交育種提供基礎。

1材料與方法

以春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種子萌發(fā)所得的直徑在0.2～0.3 cm生長旺盛的原球莖（protocorm like-body，簡稱PLB）為外植體進行增殖培養(yǎng)，對基本培養(yǎng)基、NAA、6-BA和KT進行4因素3水平的L₉（3⁴）正交試驗，各因素水平見表1。每處理接種30個原球莖，重復3次。

通過極差分析法找到較好的增殖培養(yǎng)基，在此基礎上調整培養(yǎng)基再次進行L₉（3³）正交試驗，60 d后再次統(tǒng)計增殖情況，并用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析，以鄧肯氏（Duncans）新復極差法測驗差異顯著性，以得到更適宜原球莖增殖的培養(yǎng)基配方。

注：以上培養(yǎng)基加入蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，調節(jié)pH值5.6，121℃高溫滅菌15 min。培養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±2）℃，光照12 h/d，光強2 0001x。接種60 d后統(tǒng)計原球莖增殖情況，增殖系數=增殖后的原球莖數/接種原球莖數。2結果與分析

2.1L₉（3⁴）正交試驗增殖結果分析

在培養(yǎng)過程中，原球莖隨著自身的不斷增殖而逐漸形成簇生型原球莖團（圖1），統(tǒng)計原球莖接種60 d后的增殖情況，結果見表2。

由表2可知，B4培養(yǎng)基的增殖系數最高，為6.56，明顯高于其他處理，其次是B1，增殖系數為4.84，B5培養(yǎng)基和B6培養(yǎng)基的增殖系數基本一致，差異不明顯，而B7培養(yǎng)基的增殖系數最小，僅為3.20。極差分析結果表明，基本培養(yǎng)基對原球莖增殖影響最大，其次是NAA、KT，影響最小的因子是6-BA。3種基本培養(yǎng)基中，N6的增殖效果最佳，其次是1/2MS。極差分析結果表明，4個因子最佳組合為N6+0 mg/LNAA+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/LKT，此組合即為B4培養(yǎng)基。試驗結果與極差分析都表明，原球莖增殖效果最優(yōu)的培養(yǎng)基為N6+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT。

2.2 L₉（3³）正交試驗增殖結果分析

在B4培養(yǎng)基基礎上，對其進行優(yōu)化，進一步研究各激素水平對原球莖增殖的影響。以N6為基本培養(yǎng)基，對NAA、6-BA、KT進行3因素3水平正交試驗，每處理接種30個原球莖，重復3次，60 d后增殖情況統(tǒng)計見表3。用SPSS軟件對增殖數據進行方差分析，結果見表4。對3因素進行多重比較，結果見表5。

對正交試驗9個處理進行多重比較，其差異顯著性水平與增殖系數指標的比較見圖2。由圖2可知，原球莖增殖系數最高的培養(yǎng)基是B15，達到了9.22，增殖系數最低的為B12，僅為5.07。B13、B14、B15與B10、B11、B12差異極顯著，表明培養(yǎng)基內添加適量的NAA可促進雜交種原球莖的增殖。B16與B17、B18差異極顯著，表明在NAA濃度相同時，添加一定量的6-BA和KT可提高原球莖的增殖系數。

3結論與討論

蘭花大量擴繁的有利階段是原球莖的增殖期，此時期是提高繁殖系數的核心?；九囵B(yǎng)基、植物激素的種類與濃度等都對原球莖的增殖有著至關重要的影響。本試驗結果表明，基本培養(yǎng)基是影響春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜種后代原球莖增殖的首要因素，這與魯迪研究春劍與大花蕙蘭雜交原球莖增殖培養(yǎng)所得試驗結果一致。陳小強等認為1/2MS培養(yǎng)基有利于大花蕙蘭原球莖的增殖。本試驗發(fā)現(xiàn)，原球莖在N6、1/2MS、KC等3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，N6的增殖系數最高，這與陳小強等的研究結果有所不同。這可能是因為N6培養(yǎng)基與1/2MS、KC培養(yǎng)基所含的無機鹽成分與離子濃度不同。N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物的花藥培養(yǎng)而設計的，其特點是離子濃度較低，KNO₃（NH₄）₂SO₄含量高，不含鉬，目前在蘭花類組培中也得到了廣泛應用。1/2MS培養(yǎng)基雖是將MS培養(yǎng)基大量元素減半，但其離子總量仍相對較高，不利于原球莖的增長。同時KC培養(yǎng)基與1/2MS、N6培養(yǎng)基相比，可能是因其Ca²⁺濃度較高，抑制了原球莖的增長。

在組織研究中，細胞分裂素類物質主要作用是促進細胞分裂和器官分化等，而生長素類物質主要是配合一定比例的細胞分裂素誘導不定芽的形成。因此大多研究者認為原球莖增殖階段可以適當提高6-BA濃度并降低NAA的濃度。梁一池等認為KT和NAA 2種外源激素配合使用可以對內源激素產生影響，有利于細胞分裂。楊玉珍等研究也發(fā)現(xiàn)，相同濃度的NAA配合下，大花蕙蘭對KT的敏感程度高于對6-BA的敏感程度，低濃度的KT可明顯促進原球莖的增殖。本研究中，NAA、KT、6-BA等3種外源激素對原球莖的增殖率影響都極顯著，影響順序為NAA>KT>6-BA，這與前人研究較一致。陳麗等在對墨蘭的研究中發(fā)現(xiàn)0.5 m/L NAA+1.0 mg/L 6-BA即1：2的配比，有利于墨蘭根狀莖的增殖，本研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg/L NAA+0.5或1.5 m/L 6-BA，即1：5或1：15的比例，對原球莖增殖效果最好。這可能是因為不同蘭花種類原球莖生長機理有所差異，或者是因為培養(yǎng)基中添加了較低濃度的KT，其具體原因有待進一步研究。

同時本研究仍存在一些不足，本研究所用材料來源于春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種胚無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，此類原球莖是否與組培中由莖尖、腋芽等誘導出的原球莖有所不同，仍有待以后進一步探究。因此，本研究結果僅適用于春蘭與大花蕙蘭的有性繁殖，在育種實踐中具有重要的意義。此外由于材料有限，本研究只對春蘭與大花蕙蘭1個雜交組合所得原球莖的增殖做了研究，所得原球莖增殖培養(yǎng)基是否適應于其他組合，還有待進一步確定，但仍可為春蘭與大花蕙蘭雜種原球莖生長與發(fā)育提供一定參考。