桃采后褐腐病生防酵母菌的篩選及鑒定

王 晨，盧彩鴿，劉德文，劉偉成，劉 婭，張殿朋*

(1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100094)

桃采后褐腐病生防酵母菌的篩選及鑒定

王 晨1,2，盧彩鴿2，劉德文2，劉偉成2，劉 婭1，張殿朋2*

(1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100094)

為篩選對由美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)引起的桃褐腐病具有抑制作用的酵母菌株，采用平板對峙的試驗方法，從新疆北部12個地區(qū)分離的102株酵母菌中篩選出7株對桃褐腐病菌具有顯著抑制作用的酵母菌株，其中菌株EEQS-7D拮抗活性最強，該菌株對桃褐腐病菌的抑菌率達(dá)78.90%。人為打孔接種活體試驗結(jié)果表明，該菌株可顯著降低桃褐腐病發(fā)病程度，抑制率達(dá)51.83%。生防相關(guān)性狀檢測結(jié)果顯示，該菌株能夠產(chǎn)生蛋白酶，透明圈直徑達(dá)到34.5 mm，說明EEQS-7D主要通過分泌蛋白酶達(dá)到抑制桃褐腐病的效果。通過對菌株EEQS-7D的形態(tài)特征觀察、生理生化測試以及26S rDNA序列分析，鑒定該菌株為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)。

桃褐腐??； 生物防治； 酵母菌； 篩選； 鑒定； 出芽短梗霉

據(jù)統(tǒng)計，桃采摘后因為褐腐病引發(fā)桃子腐敗變質(zhì)而導(dǎo)致的損失高達(dá)50%[1]。目前，在世界范圍內(nèi)發(fā)生較為普遍的桃褐腐病菌有3種：美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)、核果褐腐病菌(Monilinialaxa)和仁果褐腐病菌(Moniliniafructigena)[2]。其中，美澳型核果褐腐病菌引發(fā)的桃褐腐病是造成桃腐敗的最主要原因[3]。桃褐腐病導(dǎo)致桃果實在貯藏過程中出現(xiàn)大量腐爛變質(zhì)，直接影響桃的品質(zhì)，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。因此，人們迫切希望找到有效的方法來抑制桃褐腐病的發(fā)生。目前主要采用的方法是氣調(diào)、調(diào)節(jié)壓強、適當(dāng)降低貯藏溫度等物理方法配合使用化學(xué)合成農(nóng)藥[4]。但這些化學(xué)農(nóng)藥在抑制桃褐腐病的同時，也對環(huán)境和人體健康造成了巨大的危害。

利用微生物生防菌劑綜合治理病蟲害，減少有害的化學(xué)藥劑的使用，已成為應(yīng)用前景最好的替代手段之一[5]。隨著人們對生防菌的廣泛關(guān)注，一些能抑制桃采后褐腐病的絲狀真菌[6-7]、酵母[8-10]和細(xì)菌[11-13]逐漸被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用。與其他生防菌株相比，酵母菌分泌的抑菌物質(zhì)沒有過敏源等有害物質(zhì)，對人體的毒害作用微乎其微[14]，且酵母菌的營養(yǎng)需求簡單，易于培養(yǎng)，更利于大規(guī)模生產(chǎn)[15]。最近報道的李屬假絲酵母(Candidapruni)[3]、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)[9]等均對桃褐腐病有良好的生防作用。盡管國內(nèi)外利用酵母菌株防治桃褐腐病取得了一定進(jìn)展，但大多數(shù)酵母生防制劑還處于試驗階段，距離實際應(yīng)用和推廣還有很多的問題需要解決，如防治效果的加強、規(guī)模化防效測定以及環(huán)境因素的影響等。因此，篩選到防效好、適應(yīng)性廣的酵母菌是桃褐腐病生物防治工作面臨的關(guān)鍵問題。

新疆維吾爾自治區(qū)位于北緯34°25′～48°10′、東經(jīng)73°40′～96°18′，區(qū)內(nèi)形成明顯的溫帶大陸性氣候，天氣干旱少雨，晝夜溫差大(-50～49 ℃)。在此特殊生境下存活的微生物可能會具備獨特的生物與生理活性。為了尋找新的生防酵母來源，針對在新疆地區(qū)北部分離的102株酵母菌，采用平板對峙法和活體試驗相結(jié)合，從中篩選對桃褐腐病具有生防效果的菌株，以期為桃褐腐病的防治和新型生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

酵母菌：共102株，分離自新疆12個生態(tài)環(huán)境差異較大地區(qū)采集的土樣。

桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)：從北京市平谷區(qū)采集的感病桃子上分離、純化，通過-80 ℃超低溫甘油管保存在北京市農(nóng)林科學(xué)院生防微生物研究室。

試驗用桃：購于北京市農(nóng)林科學(xué)院附近市場，為新采摘桃子，品種為久保。

1.2 試劑及藥品

化學(xué)藥品與試劑均為分析純，購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；分子生物學(xué)試劑購自Tiangen Biotech公司；引物合成及測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.3 培養(yǎng)基

酵母菌株活化培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基(加硫酸鏈霉素，終質(zhì)量濃度為100 mg/mL)[3]；菌株分離與平板對峙培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[16]；生防相關(guān)性狀檢測培養(yǎng)基[17]：CAS培養(yǎng)基(檢測嗜鐵素)、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基(檢測幾丁質(zhì)酶)、脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基(檢測蛋白酶)、剛果紅培養(yǎng)基(檢測纖維素酶)、Pikovskaya’s瓊脂培養(yǎng)基(檢測磷酸酯酶)。

除脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基需在115 ℃條件下滅菌20 min外，其余培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min后待用。

1.4 生防酵母菌株的離體篩選

采用平板對峙法。將供試的桃褐腐病菌接種于PDA平板上，在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d后，用滅過菌的打孔器打取菌片，然后用無菌接種針將菌片菌絲面朝下移植于PDA平板中心。用接種環(huán)挑取少量酵母菌，在病原真菌菌片兩側(cè)等距離劃線，以僅接病原菌的平板為對照(CK)，每種處理3個重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天記錄病原菌菌落直徑，6 d后計算抑菌率。抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%[18]。

1.5 生防酵母菌株的活體篩選

以離體篩選出的生防酵母菌株作為復(fù)篩對象。選取大小、成熟度、色澤較為一致的桃子，先經(jīng)1%的NaClO溶液浸泡消毒1 min，再用無菌蒸餾水沖洗，然后用滅過菌的打孔器(直徑3 mm)在桃果實表面打出4個對稱的傷口，用移液器在傷口上滴加30 μL 1×105個/mL的桃褐腐病菌孢子懸浮液，25 ℃下放置2 h自然風(fēng)干，再接種30 μL 1×108cfu/mL的酵母菌菌懸液。以病原菌孢子懸浮液和無菌水處理作對照(CK)，同樣晾干后置于25 ℃條件下培養(yǎng)，逐日記錄桃果實的病斑直徑，6 d后計算抑菌率。抑菌率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑×100%。每個處理選取15個果實，2次重復(fù)。根據(jù)篩選結(jié)果，選取離體和活體抑菌活性強的菌株作為下一步深入研究對象。

1.6 菌株EEQS-7D的生防相關(guān)性狀檢測

將菌株EEQS-7D在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，點種于生防相關(guān)性狀檢測培養(yǎng)基平板上(每個處理設(shè)3個重復(fù))，28 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行觀察記錄。根據(jù)平板上暈圈或透明圈直徑的大小，初步檢測EEQS-7D的產(chǎn)素能力[19]。

1.7 菌株EEQS-7D的鑒定

1.7.1 形態(tài)特征鑒定 將酵母菌株EEQS-7D在YPD平板上28 ℃活化培養(yǎng)，3 d后觀察菌株的菌落形態(tài)、大小、顏色、透明度、突起和邊緣情況。用顯微鏡觀察該菌株的菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.7.2 分子生物學(xué)鑒定 采用酵母菌PCR擴(kuò)增通用引物(NL1-f:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；NL4-r:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴(kuò)增26S rDNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，目標(biāo)條帶經(jīng)切膠回收純化后，送至北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測序。將測定的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫中，并與現(xiàn)有的同源性較近的菌株序列進(jìn)行比對。進(jìn)化距離的計算采用鄰接法[20]，進(jìn)化樹分支模式的穩(wěn)定性用MEGA 5.0軟件[21]分析，采用bootstrap法(復(fù)次數(shù)為1 000)構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.7.3 生理生化試驗 參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》[22]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理均采用SPSS統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防酵母菌株的離體篩選結(jié)果

采用平板對峙法對分離自新疆土樣的102株酵母菌進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，其中20株酵母菌對桃褐腐病菌具有一定的抑制作用，部分結(jié)果見圖1和表1。

圖1 拮抗桃褐腐病菌生防酵母的篩選

菌株編號菌落直徑/mm抑菌率/%WSTLX-sun224．68±0．35e72．58±0．39bCHE-18D27．62±0．01c69．31±0．01dWSTLX2-329．98±0．34b67．69±0．38eEEQS-7C25．79±0．69de71．35±0．77bcEEQS-7D18．99±0．61f78．90±0．68aWSTLX1-2DP29．91±0．64b66．77±0．72eEEQS-9C26．67±0．52cd69．70±1．08cdCK90．00±0．00a

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

試驗篩選出7株對桃褐腐病菌具有較強抑制作用的酵母菌株，抑菌率均在65%以上，分別為WSTLX-sun2、WSTLX2-3、EEQS-7C、EEQS-7D、EEQS-18D、WSTLX1-2DP、EEQS-9C，其中EEQS-7D的抑菌率最高，達(dá)到了78.90%(表1)。

2.2 生防酵母菌株的活體篩選結(jié)果

從表2可知，酵母菌株EEQS-7D、CHE-18D和WSTLX1-2DP的抑菌效果較好，處理后6 d對桃褐腐病菌的抑菌率分別為51.83%、51.43%和46.66%，病斑直徑分別為28.89 mm、29.13 mm和32.00 mm。圖2為部分酵母菌株處理桃子的發(fā)病情況，可以看出，EEQS-7D處理的桃子發(fā)病最輕。綜合離體和活體的抑菌活性篩選結(jié)果，將EEQS-7D菌株確定為下一步深入研究對象。

表2 不同的酵母菌懸浮液對桃子病斑直徑的影響

圖2 不同處理桃子的發(fā)病情況

2.3 菌株EEQS-7D的生防相關(guān)性狀檢測結(jié)果

在生防相關(guān)性狀檢測中，菌株EEQS-7D在蛋白酶檢測平板上能夠形成明顯的透明圈，其直徑達(dá)到34.5 mm(圖3)，在其他檢測平板上沒有這種現(xiàn)象，說明EEQS-7D主要通過分泌蛋白酶達(dá)到抑制桃褐腐病的效果。

圖3 EEQS-7D菌株產(chǎn)生蛋白酶情況

2.4 菌株EEQS-7D的鑒定結(jié)果

2.4.1 菌落及菌體特征 EEQS-7D菌株在100倍光學(xué)顯微鏡下，菌體細(xì)胞呈圓柱形或臘腸形(8～10)μm×(20～40)μm，單個，具有運動性；在YPD培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)淺褐色，濕潤，黏稠，易挑起，表面光滑，隨著培養(yǎng)時間增長，菌落變厚，邊緣整齊，菌落上無褶皺，顏色變深(圖4)。

圖4 EEQS-7D菌株的菌體及菌落形態(tài)

2.4.2 生理生化特征 從表3可知，EEQS-7D菌株是一株耐堿性酵母菌，在pH值 7.5～9.5的環(huán)境下正常生長。其能利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖、可溶性淀粉、纖維二糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖和D-阿拉伯糖，對海藻糖、松三糖、肌醇、木糖和鼠李糖可微弱利用。在35 ℃和37 ℃下生長良好，40 ℃下不能生長。

2.4.3 分子鑒定 以EEQS-7D菌株基因組DNA

表3 EEQS-7D菌株的生理生化特性測定結(jié)果

注:“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)；“W”表示反應(yīng)弱。

為模板，采用酵母通用引物NL1-f/NL4-r擴(kuò)增其26S rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為616 bp的單一條帶。經(jīng)序列測定，得到EEQS-7D菌株的26S rDNA序列，選取同源性較高的菌株序列進(jìn)行比對后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 5)。從圖5可以看出，EEQS-7D菌株與出芽短梗霉菌株的26S rDNA序列處于同一分支，相似度達(dá)到了99%。綜合形態(tài)觀察以及生理生化特性測定結(jié)果，最終確定菌株EEQS-7D為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)。

圖5 菌株EEQS-7D的26S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)報道，出芽短梗霉是一種具有廣譜抑菌活性的生防酵母菌株，其對多種病原菌均具有不同程度的拮抗作用[23]。研究表明，其主要通過營養(yǎng)和空間競爭、誘導(dǎo)抗性以及分泌抑菌活性代謝產(chǎn)物等[24]達(dá)到抑制病原菌的效果。這種抑制作用既可以抑制病原菌的增殖，還可以避免病原菌產(chǎn)生抗性而降低防治效果。出芽短梗霉廣泛分布于植物[25]和腐爛的蘋果、葡萄、櫻桃等水果表面[26]，此外，其在食品工業(yè)中也得到了廣泛的應(yīng)用，這些都表明出芽短梗霉是一類對人體無害的菌株。因此，它符合人們對于生防酵母菌種的選擇標(biāo)準(zhǔn)。

本研究成功篩選出了一株對桃褐腐病菌抑菌效果較好的出芽短梗霉EEQS-7D?；铙w試驗中，接種桃褐腐病菌的桃子經(jīng)EEQS-7D處理6 d后，病斑直徑為28.89 mm。這與Mari等[23]的研究結(jié)果相一致。在他們的試驗中，采用相同濃度(1×108cfu/mL)的出芽短梗霉L1和L8菌懸液對桃果實進(jìn)行處理，6 d后桃子上的病斑直徑分別為27 mm和43 mm。EEQS-7D的抑菌效果低于L1而高于L8，說明同種酵母之間的抑菌效果也具有明顯的差異。這可能是因為不同來源的菌株其結(jié)構(gòu)和生理不同，因而造成了其對桃褐腐病菌的抑制率產(chǎn)生很大的差異。

經(jīng)過驗證，EEQS-7D能夠大量分泌蛋白酶，表明它可能主要通過分泌蛋白酶達(dá)到抑制病原菌的效果，這與Zhang等[27]的研究結(jié)果相接近。Zhang等[27]篩選出一株能夠產(chǎn)生葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等水解酶的出芽短梗霉PL5，其對桃褐腐病具有較為顯著的防治效果。

盡管EEQS-7D是一株較為有效的生防酵母菌株，但目前只對它的抑菌效果進(jìn)行了初步驗證，要將該菌株大規(guī)模地應(yīng)用于桃褐腐病的防治，還需對其安全性、生防菌劑的研制、菌劑濃度對防效的影響、作用機制及規(guī)?；佬У冗M(jìn)行深入的研究。

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Screening and Identification of Yeast Strains to Control Brown Rot of Postharvest Peaches

WANG Chen1,2,LU Caige2,LIU Dewen2,LIU Weicheng2,LIU Ya1,ZHANG Dianpeng2*

(1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Institute of Plant and Environment Protection,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing 100094,China)

In order to choose yeast strains with strong antagonistic activity againstMoniliniafructicola,which causes peach brown rot,7 yeast strains were selected by the dural culture method from 102 yeast strains collected from 12 sampling sites in northern Xinjiang.In particular,the strain EEQS-7D was the best among these 7 strains,which reduced the growth ofM.fructicolaby 78.90%.The result ofinvivotest illustrated that this strain could significantly reduce the incidence of brown rot on peaches by 51.83%.The strain was capable of producing protease,and the transparent circle diameter reached 34.5 mm,which indicated that EEQS-7D could inhibit peach brown rot disease mainly by secreting protease.The strain EEQS-7D was identified asAureobasidiumpullulansbased on its morphological observation,physiological and biochemical determination and 26S rDNA sequence analysis.

peach brown rot; biological control; yeast; selection; identification;Aureobasidiumpullulans

2016-11-17

北京市自然科學(xué)基金項目(6154026)；北京市科委科技計劃課題(Z141100002614006)

王 晨(1991-)，男，新疆吐魯番人，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。 E-mail：524490731@qq.com

*通訊作者：張殿朋(1980-)，男，河南周口人，副研究員，博士，主要從事果蔬采后病害生防菌劑研究及產(chǎn)品開發(fā)。 E-mail：dreamstar26@126.com

S436.621.1;S476

A

1004-3268(2017)05-0090-05