LETM2在食管鱗癌中的表達及其作用*

胡曉玲 翟元芳 楊 潔 王 娟 畢煬輝 楊 斌③ 程彩霞④ 宋 彬⑤ 張 玲 孔鵬洲

·基礎研究·

LETM2在食管鱗癌中的表達及其作用*

胡曉玲①②翟元芳②楊 潔②王 娟②畢煬輝②楊 斌②③程彩霞②④宋 彬②⑤張 玲②孔鵬洲②

目的：探討LETM2在食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的表達，研究LETM2對ESCC細胞系KYSE150和ECA109增殖和侵襲遷移的影響。方法：免疫組化（immunohistochemistry，IHC）檢測90例ESCC及癌旁組織LETM2蛋白表達差異，RT-PCR和Western blot檢測ESCC細胞系LETM2表達情況，慢病毒敲低KYSE150和ECA109細胞中LETM2表達。MTT和克隆形成技術檢測LETM2對ESCC細胞增殖和克隆形成能力的影響，流式細胞術檢測細胞周期變化，Transwell法分析LETM2敲低后細胞遷移侵襲能力的差異。結果：在ESCC組織中LETM2的表達顯著高于癌旁組織，LETM2通過抑制ESCC細胞G1期向S期轉化進而抑制細胞增殖，但對侵襲和遷移能力影響不大。結論：LETM2可能作為驅動基因促進ESCC的發(fā)生發(fā)展，是ESCC的關鍵遺傳變異，可能作為ESCC早診早治的分子標志物。

食管鱗癌LETM2增殖侵襲遷移細胞周期

我國是全球范圍內食管癌高發(fā)區(qū)之一，發(fā)病率居于第8，死亡率位于第6［1］。組織學類型主要以鱗癌為主，世界上約70%的食管鱗癌（esophageal squa?mous cell carcinoma，ESCC）發(fā)生在我國［2-3］。由于早期ESCC缺乏特異性癥狀和診斷指標，發(fā)現(xiàn)時往往已經是中晚期，預后極差，目前我國ESCC的5年生存率僅為15%～25%［4-5］。因此，找到ESCC發(fā)生發(fā)展的相關遺傳變異因素，尋找早期診斷的腫瘤標志物對提高ESCC的臨床預后具有重要意義。

本課題組前期對收集的山西省腫瘤醫(yī)院31例ESCC病例進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)LETM2（leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2，LETM2）基因所在區(qū)域存在拷貝數(shù)擴增。LETM2定位于染色體8p11.23，屬于線粒體蛋白，主要在精母細胞和精子中表達［6］。然而對LETM2在ESCC中的表達及其功能尚無研究報道。本文研究結果顯示，與正常組織相比，LETM2在ESCC組織中高表達，在LETM2表達較高的食管鱗癌細胞KYSE150和ECA109細胞系敲低LETM2后顯著抑制細胞生長，而細胞侵襲遷移能力變化不大，提示在ESCC的發(fā)生發(fā)展過程中，LETM2可能起促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人ESCC細胞株KYSE150、ECA109、EC9706由中國工程院詹啟敏院士饋贈，TE-1、KYSE180、KYSE140、KYSE510、KYSE410均購自中科院上海細胞庫。90例人ESCC組織和癌旁組織取自2011年至2014年在山西省腫瘤醫(yī)院手術患者。所取標本均提前和患者及/或家屬進行溝通，在征得患者及/或家屬同意并簽署《知情同意書》后再進行取材。實驗所需RMPI 1640培養(yǎng)液和新生胎牛血清購自美國Hyclone公司，質粒抽提試劑盒購自美國Qiagen公司。所用質粒Plko.1-puro-shRNA-LETM2由美國普爾普樂公司合成。PMDG、PAPSX質粒均由本室保存。RNA提取所用試劑及PCR試劑盒由美國Takala公司提供，由上海生工合成所用引物。兔抗人LETM2抗體購自美國Abclam公司，羊抗兔二抗購自武漢三鷹公司。Western blot所用試劑購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法①切片常規(guī)脫蠟；②3% H2O215 min阻斷內源性過氧化物酶；③抗原暴露；④4℃孵育過夜；⑤復溫1 h；⑥二抗37℃孵育20 min；⑦DAB顯色；⑧將細胞核用蘇木素復染，鹽酸酒精分化多余蘇木素，氨水返藍；⑨梯度酒精和二甲苯脫水；⑩中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。

1.2.2 細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)KYSE150和ECA109細胞，置于5% CO2孵箱37℃培養(yǎng)，根據(jù)細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)液，當細胞長到80%～90%融合度時進行傳代。

1.2.3 慢病毒感染HEK-293細胞轉染前一天接種于6孔板，第二天細胞長到70%融合度時，將Plko.1-puro-GFP-shRNA-LETM2、PMDG、PAPSX三種質粒按1:2：1共8 μg與Lipofectamine2000 16 μL混合轉染，48～72 h收集上清，過濾后加到貼壁培養(yǎng)的KYSE150和ECA109細胞中。感染48 h后加入嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲除LETM2的KYSE150和ECA109細胞系，命名為LETM2sh1和LETM2sh2，陰性對照則轉染無意義亂碼序列，命名為NC。敲低序列LETM2-sh1：5'-CGCACCTTC?TACCTGATAGAT-3'和LETM2-sh2：5'-CCAGTTA?CATCATCACCCATA-3'。

1.2.4 實時定量PCR（real-time polymerase chain re?action，RT-PCR）收集細胞沉淀，RNA提取后逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增。反應體系為25 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，Primer（10 μM）1 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.5 μL，cDNA 1μL，ddH2O 10.5 μL，根據(jù)Genebank中LEMT2序列及GAP?DH序列，設計PCR特異性擴增引物。序列如下：LETM2上游引物：5'-GGAGGGGTTCTTGCACTACT-3'，下游引物：5’-GAATTGATGCAACCTGGCCA-3'。GAPDH上游引物：5'-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3'，下游引物：5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。

1.2.5 蛋白質印跡法（Western blot）①胰酶消化；②收集細胞；③裂解液冰上裂解；④離心收集上清；⑤Bradford法測蛋白濃度；⑥SDS-PAGE凝膠電泳；⑦恒壓8 V轉膜過夜；⑧5%脫脂奶粉封閉；⑨一抗二抗孵育；⑩顯影并進行分析。

1.2.6MTT取96孔板將各組細胞用0.25%胰酶消化，離心，計數(shù)后接種，5×103個細胞/孔，每孔加200 μL 10%FBS培養(yǎng)基，于24、48、72、96、120 h后每孔加入20 μL MTT（5 mg/ml），37℃孵箱孵育4 h后每孔加入200 μL DMSO，振蕩15 min后在490 nm吸光度下檢測光密度值。

1.2.7 克隆形成實驗取6孔板接種相應各組細胞，5×102個/孔，每孔加2 mL培養(yǎng)基，14～20天后，PBS清洗后用4%多聚甲醛進行固定，0.1%結晶紫染色，計數(shù)有效克?。ā?0個細胞）。

1.2.8Transwell實驗將相應各組細胞0.25%胰酶消化，計數(shù)后Transwell小室上室內加5×104個細胞/孔，200 μL基礎培養(yǎng)基，下室加600 μL 10%FBS完全培養(yǎng)基，24 h后4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，觀察穿過上室下層薄膜的細胞并計數(shù)拍照。

1.2.9 流式細胞術細胞PBS洗滌，胰酶消化，收集沉淀，70%冰乙醇固定，去除乙醇，0.01%DNase-free RNase A 37℃處理10 min，0.05%PI 4℃染色20 min。應用FACSCalibur流式細胞分析儀分析細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0軟件分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，秩和檢驗應用于LETM2在ESCC組織和癌旁組織表達情況比較，其他實驗數(shù)據(jù)兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在ESCC組織中LETM2表達高于正常組織

利用免疫組織化學法檢測ESCC組織芯片中ES?CC組織與癌旁組織LETM2蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)ES?CC組織中LETM2表達高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（圖1，P＜0.05）。

圖1 在ESCC組織中LETM2表達高于相鄰正常組織Figure1 LETM2 was frequently upregulated in the ESCC tissues than in the adjacent non‐tumor tissues

2.2 在KYSE150和ECA109敲除LETM2成功

RT-PCR和Western blot比較食管鱗癌細胞株KYSE150、ECA109、EC9706、TE-1、KYSE180、KYSE140、KYSE510和KYSR410中LETM2表達量，選擇LETM2表達量比較高的KYSE150和ECA109用于行敲除實驗。RT-PCR和Western blot實驗結果顯示在KYSE150和ECA109采用慢病毒轉染Plko.1-puro-shRNA-LETM2后，LETM2基因表達與NC組相比明顯降低（圖2）。

2.3LETM2對ESCC細胞增殖的影響

經MTT法檢測結果顯示，與對照組相比，敲低LETM2后，KYSE150和ECA109細胞增殖能力明顯降低，在48、72、96、120 h差異均有統(tǒng)計學意義（圖3A）。

克隆形成實驗顯示在KYSE150和ECA109細胞敲低LETM2后，與對照組相比形成克隆數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計學意義（圖3B）。

2.4LETM2對ESCC細胞侵襲遷移的影響

細胞遷移和侵襲實驗結果顯示，敲低LETM2后，KYSE150和ECA109細胞侵襲遷移能力雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義。

2.5LETM2對ESCC細胞周期的影響

采用流式細胞技術檢測LETM2是否通過改變ESCC細胞周期而影響細胞增殖。結果顯示在KYSE150和ECA109細胞敲低LETM2后，與對照組相比，G1期上升，S期下降，差異具有統(tǒng)計學意義（表1）。

圖2 在KYSE150和ECA109敲除LETM2成功Figure2 Effective knockdown of LETM2 in KYSE150 and ECA109 cell lines

圖3 敲低LETM2抑制ESCC細胞增殖和克隆形成Figure3 Inhibition of ESCC cell growth and colony formation by the LETM2 knockdown

表1 在KYSE150和ECA109細胞敲除LETM2后細胞周期檢測Table1 Cell cycle distribution of LETM2 knockdown in KYSE150 and ECA109 cells

3 討論

腫瘤與遺傳因素間的關系逐漸被人們重視，基因組技術的不斷發(fā)展給相關研究帶來了契機。隨著第二代測序技術的發(fā)展和完善，腫瘤基因組學研究有了質的突破，由原來的假說為導向轉變?yōu)橐詳?shù)據(jù)為導向的研究，能夠客觀地反映在疾病發(fā)生進展過程中組學層面所發(fā)生的變化。而且，第二代測序技術具有高通量、“一攬子”的優(yōu)點，可能發(fā)現(xiàn)全新的腫瘤相關遺傳變異和分子信號通路。

本課題組對前期收集的31例食管鱗癌病例進行全基因組測序，找到了與食管鱗癌相關的基因組序列組成與結構的變化，包括單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）、插入與缺失（insertion and deletion，Indels）、結構變異（structure variation，SV）和拷貝數(shù)變化（copy number variation，CNV）等。Meerkat方法分析了全基因組測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ESCC基因組局部區(qū)域存在擴增現(xiàn)象，LETM2所在區(qū)域即為其中之一［7］。

LETM2即亮氨酸拉鏈EF-hand結構域跨膜蛋白2，是最近新發(fā)現(xiàn)的定位于線粒體內膜的在酵母和人類之間高度保守的蛋白。線粒體功能的正常是細胞保持正常生理活動所必需，其功能紊亂會引起癌癥等疾病發(fā)生［6］。線粒體功能紊亂可以影響癌細胞的生長、凋亡和能量代謝，目前對LEMT2的研究甚少，只有Dutt等［6］曾報道其在非小細胞肺癌存在擴增。目前對LETM1的研究相對較多，LETM1最先被發(fā)現(xiàn)可以誘發(fā)沃爾夫綜合征（Wolf-Hirschhorn Syn?drome），并且與癲癇的發(fā)病相關［8-10］。近期有研究表明，在宮頸癌中LEMT1表達增加可抑制細胞凋亡，可能通過激活PI3K-Akt信號通路來促進腫瘤發(fā)生發(fā)展［11］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中LEMT1發(fā)揮重要作用，可能作為肝癌分子治療靶點［12-13］。在乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌均存在LETM1高表達現(xiàn)象，并且與乳腺癌臨床特征和生存期存在相關性［14-16］。作為LEMT1類似物，本文通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)LEMT2在ESCC組織中存在拷貝數(shù)擴增，免疫組織化學結果發(fā)現(xiàn)LEMT2在ESCC中顯著高表達，提示在ESCC的發(fā)生進展過程中LETM2發(fā)揮關鍵作用。在LEMT2高表達的食管鱗癌細胞系敲低LEMT2后，抑制細胞G1期向S期轉化進而抑制細胞增殖和克隆形成，但對侵襲遷移影響不大。

因此，LEMT2在ESCC發(fā)生發(fā)展中可能作為驅動基因進而影響ESCC進程，但對于其在ESCC發(fā)展中的具體分子機制還需在后續(xù)的研究中進一步探討。

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（2016‐12‐23收稿）

（2017‐04‐07修回）

Expression and function of LETM2 in esophageal squamous carcinoma

Xiaoling HU1,2,Yuanfang ZHAI2,Jie YANG2,Juan WANG2,Yanghui BI2,Bin YANG2,3,Caixia CHENG2,4,Bin SONG2,5,Ling ZHANG2,Pengzhou KONG2

1Department of Pharmacology,2Translational Medicine Research Center,Key Laboratory of Cellular Physiology,Ministry of Education, Shanxi Medical University,Taiyuan 030001 China;3Department of General Surgery,Shanxi Provincial Cancer Hospital,Taiyuan 030013, China;4Department of Pathology,5Department of Oncology,The First Hospital,Shanxi Medical Univesity,Taiyuan 030001,China

Pengzhou KONG;E‐mail:kongpzh@163.com

Objective:To analyze the expression of LETM2 in KYSE150 and ECA109 cell lines and its effect on the proliferation,migra‐tion,and invasion of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods:The expression level of the LETM2 protein in 90 paired hu‐man ESCC tissues and matched adjacent normal tissues was determined through immunohistochemistry.The expression level of LETM2 in ESCC cell lines was detected by real‐time PCR and Western blot.The expression levels of LETM2 in KYSE150 and ECA109 cell lines were knocked down using lentivirus.MTT assays were performed to examine the effect of LETM2 on the proliferation of ESCC cells.Colony formation assay was used to detect the colony formation ability.Flow cytometry was performed to analyze the cell cycle. The effect of LETM2 depletion on the migration and invasion of ESCC cells was determined by Transwell assay.Results:LETM2 expres‐sion was frequently upregulated in the ESCC tissues than in the adjacent normal tissues.The suppressed exogenous expression of LETM2 led to the inhibition of cell proliferation and colony formation.However,cell migration and invasion were not affected.The re‐sults on the cell cycle distribution revealed that LETM2 knockdown acts as a negative regulator of the cell cycle at the G1to S phase transition.Conclusion:LETM2 acts as a tumor‐driven gene in the development and progression of ESCC.This finding suggests that LETM2 can be used as an efficient prognosis biomarker and a potential therapeutic target for ESCC.

ESCC,LETM2,proliferation,invasion,migration,cell cycle

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.08.460

①山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理教研室（太原市030001）；②轉化醫(yī)學研究中心細胞生理學省部共建教育部重點實驗室；③山西省腫瘤醫(yī)院；④山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院病理科；⑤山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院腫瘤內科

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81502135），山西醫(yī)科大學博士啟動基金（編號：03201006），山西醫(yī)科大學青年基金（編號：057487）資助

孔鵬洲kongpzh@163.com

胡曉玲專業(yè)方向為腫瘤病因學。

E-mail：hxl0351@163.com