氧化苦參堿對(duì)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用

張燕+李玲+王俊燕+王銀+李云鴻

（1.寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004；2.銀川市第一人民醫(yī)院，寧夏 銀川 750004）

摘要：目的：研究氧化苦參堿（OMT）對(duì)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及機(jī)制。方法：培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Con），細(xì)菌脂多糖（LPS）組，OMT實(shí)驗(yàn)組。應(yīng)用western-blot檢測(cè)OMT對(duì)LPS激活的BV2細(xì)胞HSP60的影響，ELISA檢測(cè)OMT對(duì)HSP60和TNF-α釋放的作用。結(jié)果：LPS組中HSP60的表達(dá)及HSP60、TNF-α的釋放都比對(duì)照組顯著增加，加入OMT后，這些因子的水平都明顯降低。結(jié)論：OMT可能抑制通過(guò)HSP60信號(hào)通路降低炎癥因子的產(chǎn)生而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：熱休克蛋白60；氧化苦參堿；小膠質(zhì)細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：G642.423 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2017）18-0279-02

氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）是中藥苦參的提取物。研究證明氧化苦參堿擁有抗炎、抗腫瘤等許多藥理學(xué)功能[1]，但OMT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用仍未知。熱休克蛋白60（HSP60）是一類(lèi)應(yīng)激蛋白，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。但研究表明，在病理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)HSP60，并將其釋放到胞外，作為自身免疫因子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。我們前期研究表明枸杞多糖可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞HSP60的表達(dá)及釋放而起到神經(jīng)保護(hù)作用[3]。本研究將探討OMT是否具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用。

一、材料與方法

（一）材料

氧化苦參堿和LPS購(gòu)自Sigma公司；HSP60抗體購(gòu)自ENZO公司；β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；BCA試劑盒購(gòu)自Thermo公司；HSP60和TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛公司。

（二）方法

1.BV2細(xì)胞的培養(yǎng)。BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。BV2細(xì)胞中加入1μg/ml LPS 30min后，加入20μg/ml的OMT溶液處理24小時(shí)后收集細(xì)胞總蛋白及上清液。

2.利用Western blot檢測(cè)HSP60表達(dá)。藥物處理完畢，提取各組的蛋白并收集上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。利用10% SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用脫脂牛奶在搖床上封閉膜2h。加入一抗，4℃過(guò)夜。利用TBST充分洗滌膜后，用二抗室溫孵育1h，ECL試劑顯色成像。

3.利用ELISA檢測(cè)HSP60及TNF-α的釋放。應(yīng)用HSP60和TNF-α ELISA試劑盒，依據(jù)操作步驟，在酶標(biāo)儀上450nm處測(cè)定各孔光密度值（OD）。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS11.9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用方差分析，進(jìn)一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-KeulsTest方法。

二、結(jié)果

（一）OMT抑制LPS激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞中的HSP60的表達(dá)及釋放

Western blot檢測(cè)HSP60的表達(dá)情況，結(jié)果表明與CTRL組相比較，LPS顯著增加了HSP60的表達(dá)，而OMT能減少HSP60的產(chǎn)生（P<0.05）。ELISA檢測(cè)細(xì)胞外分泌的HSP60的實(shí)驗(yàn)表明，LPS增加了HSP60的釋放，而OMT能減少細(xì)胞外HSP60的釋放。

（二）OMT抑制激活的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生

ELISA結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，LPS處理后的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α的釋放明顯增加，在OMT處理的實(shí)驗(yàn)組中，TNF-α的產(chǎn)生顯著下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

三、討論

許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)，阻止小膠質(zhì)細(xì)胞的激活特別是阻止生成神經(jīng)毒性因子，可作為治療神經(jīng)退行性疾病的方法之一[4]。OMT是中藥苦參的一種主要成分，并且擁有多種藥理學(xué)優(yōu)點(diǎn)[5]。研究顯示在大鼠的大腦局部缺血的模型中，OMT能夠減少NF-κB的產(chǎn)生和抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎性反應(yīng)從而減小大腦的損傷[6]。然而OMT的神經(jīng)保護(hù)功能機(jī)制尚不明確。本文中，我們研究了OMT的神經(jīng)保護(hù)功能及分子機(jī)制。HSP60在心衰病人中被發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜和分泌到細(xì)胞外[7]。但是HSP60在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用研究報(bào)道還很少。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BV2經(jīng)LPS激活后，胞內(nèi)HSP60的表達(dá)明顯增高，并將其釋放至胞外，引起炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生。而OMT可抑制胞內(nèi)HSP60的表達(dá)，胞外的釋放及TNF-α的產(chǎn)生，可能是一種潛在的治療神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的藥物。

參考文獻(xiàn)：

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[6]Liu Y，Zhang XJ，Yang CH：Oxymatrine protectsrat brains against permanent focal ischemia and downregulates NF- kappaB expression. J Brain Res 1268：174-180，2009.

[7]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A. Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis [J].Circ Res，2009；105：1186 1195.

收稿日期：2016-11-30

基金項(xiàng)目：2016年寧夏回族自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（NXCX2016122）

作者簡(jiǎn)介：張燕（1993-），女（漢族），寧夏銀川人，寧夏醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)本科生；李玲（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，專(zhuān)科，主治醫(yī)師，銀川市第一人民醫(yī)院高壓氧科，主要從事高壓氧神經(jīng)科學(xué)研究；王俊燕（1992-），女，寧夏銀川人，寧夏醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)本科生；王銀（1973-），女（漢族），寧夏銀川人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，寧夏醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系主任，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。

通訊作者：李云鴻（1972-），男（漢族），寧夏銀川人，副教授，碩士，寧夏醫(yī)科大學(xué)，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。