甲狀旁腺素通過調(diào)控初級(jí)纖毛的表達(dá)促進(jìn)軟骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲*

許 凱， 向 威， 成薇婷

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，武漢 430022

甲狀旁腺素通過調(diào)控初級(jí)纖毛的表達(dá)促進(jìn)軟骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲*

許 凱1#， 向 威1#， 成薇婷2△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，武漢 430022

目的 探究甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)對(duì)軟骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，及其與初始纖毛表達(dá)調(diào)控之間的相互關(guān)系。方法 應(yīng)用不同濃度PTH刺激軟骨肉瘤細(xì)胞SW1353，缺氧誘導(dǎo)纖毛表達(dá)和水合氯醛破壞纖毛結(jié)構(gòu)后，通過CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，Western blot及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW1353細(xì)胞的增殖和侵襲能力，免疫熒光計(jì)數(shù)初始纖毛表達(dá)情況，熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)目的基因GLI1、PTCH1和IFT88的表達(dá)情況。結(jié)果 PTH能促進(jìn)軟骨肉瘤細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性，其促增殖效應(yīng)與纖毛結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)；PTH能上調(diào)SW1353細(xì)胞的侵襲能力，增加基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的表達(dá)，破壞纖毛結(jié)構(gòu)后，PTH促進(jìn)軟骨肉瘤的侵襲效應(yīng)受到抑制；PTH下調(diào)SW1353細(xì)胞初始纖毛的數(shù)量，其效應(yīng)與纖毛結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)；PTH能調(diào)控Hedgehog通路靶基因GLI1、PTCH1及纖毛功能相關(guān)基因IFT88的表達(dá)。結(jié)論 PTH能促進(jìn)軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，同時(shí)抑制軟骨肉瘤細(xì)胞初級(jí)纖毛的表達(dá)并影響其下游靶基因表達(dá)，PTH可能通過作用于初始纖毛來調(diào)控軟骨肉瘤的惡性生物學(xué)特性。

甲狀旁腺素； 人軟骨肉瘤； 增殖； 侵襲； 初始纖毛

軟骨肉瘤是以分泌軟骨樣基質(zhì)為特征的惡性骨腫瘤，其增殖和侵襲等惡性生物學(xué)特性與其分化程度有關(guān)，常好發(fā)于20歲以上青壯年，10年生存率波動(dòng)于29%到83%之間。由于軟骨肉瘤組織中缺乏血管并分泌有致密的軟骨樣基質(zhì)保護(hù)，軟骨肉瘤對(duì)常規(guī)化療和放療均不敏感，手術(shù)切除是目前主流的治療方法[1-2]。因此，對(duì)軟骨肉瘤惡性生物學(xué)進(jìn)程的機(jī)制研究，將為明確腫瘤發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的治療方法提供重要的依據(jù)。

甲狀旁腺素(PTH)是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣平衡來影響骨和軟骨生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)因子[3]。在正常軟骨發(fā)育過程中，內(nèi)源性甲狀旁腺素相關(guān)肽PTHrP與刺猬蛋白(Hedgehog，Hh)構(gòu)成的PTHrP /Hedgehog負(fù)反饋環(huán)路發(fā)揮重要作用。Ihh蛋白促進(jìn)PTH分泌表達(dá)，使細(xì)胞保持增殖狀態(tài)，反之PTH則抑制Ihh蛋白的表達(dá)，阻止細(xì)胞向肥大方向分化，這種負(fù)反饋環(huán)路有助于調(diào)控軟骨細(xì)胞的成熟和推遲軟骨內(nèi)骨化，從而有助于維持正常的結(jié)構(gòu)和功能[4]。

然而，在某些腫瘤中通?？梢詸z測(cè)到異常表達(dá)的PTH，如骨巨細(xì)胞瘤及各種骨轉(zhuǎn)移瘤，這些腫瘤常伴隨溶骨性破壞及高鈣血癥，影響骨與軟骨的結(jié)構(gòu)和功能[5-6]。初始纖毛作為一種具有感受器功能的細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)過程。初始纖毛能感受細(xì)胞微環(huán)境中的物理及化學(xué)刺激，參與多種信號(hào)通路的傳遞過程，如Hedgehog和Wnt信號(hào)通路等[7]。此外，初始纖毛的重構(gòu)還是細(xì)胞有絲分裂結(jié)束的重要標(biāo)志[8]。很多研究已經(jīng)證明：初始纖毛功能紊亂與腫瘤發(fā)生密切聯(lián)系，如胃腸腫瘤、乳腺癌等[9-10]，因此，探究初始纖毛在軟骨肉瘤中的表達(dá)情況及對(duì)PTH信號(hào)調(diào)控作用的影響將為明確軟骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人軟骨肉瘤細(xì)胞系SW1353購自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。人重組PTH(1-84)購買于Prospec公司。應(yīng)用5～200 nmol/L的重組人PTH(1-84)作用SW1353細(xì)胞24 h，分為對(duì)照組和不同濃度梯度PTH干預(yù)組，并確定PTH的最佳干預(yù)濃度。通過使用無血清培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞6 h以誘導(dǎo)初始纖毛表達(dá)或加入40 μmol/L水合氯醛破壞纖毛與基底部的連接而抑制纖毛形成，分為纖毛誘導(dǎo)組和纖毛解構(gòu)組，再分別加入最佳濃度的PTH進(jìn)行干預(yù)。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

通過CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTH對(duì)軟骨肉瘤細(xì)胞SW1353增殖能力的影響。首先以2 000個(gè)/孔的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)干預(yù)試劑，并在100 μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間培養(yǎng)。然后在每孔中加入10 μL的CCK8試劑(武漢博士德公司)，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值，細(xì)胞活力用A值表示。

1.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

通過運(yùn)用Transwell腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)來評(píng)估軟骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。在Transwell小室內(nèi)膜(孔徑為8 μm)上均勻涂布30 μL的基質(zhì)膠(與培養(yǎng)液以1∶4稀釋)并在37℃下孵育30 min以凝固，下部腔室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液。先將SW1353細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液中饑餓6 h，消化后以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度將200 μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小室上部。根據(jù)不同分組，分別加入100 nmol/L的PTH及40 μL的水合氯醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。24 h后，棉簽輕輕拭去上層基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS清洗3遍后行結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選擇10個(gè)視野在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

適當(dāng)密度的軟骨肉瘤SW1353細(xì)胞接種在蓋玻片上，經(jīng)不同干預(yù)刺激24 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.5%BSA在室溫下封閉60 min，然后用小鼠來源的乙?；廖⒐艿鞍卓贵w(1：300，Abcam公司)在4℃下孵育過夜。PBS洗滌3遍后用CY3標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗在室溫下孵育1 h，再用1 μg/μL DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，PBS洗滌3遍后用熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞總蛋白，制備上樣緩沖液，以每孔20 μg蛋白上樣進(jìn)行電泳分離，濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5% BSA封閉1 h，用MMP9抗體(1：1 000，Cell Signaling Technology公司)和β-actin抗體(1：400，博士德公司)4℃孵育過夜，洗膜3次后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶5 000，博士德公司)孵育1 h，常規(guī)洗膜，ECL熒光顯色系統(tǒng)暗室成像。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR

用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，再通過RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)合成2～5 μg cDNA。全套PCR系統(tǒng)包含cDNA、SYBR Green、無RNA酶、水和引物。引物序列為：hβ-actin，5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，5′-CTCCTTAATGTCAC-GCACGAT3′；hPTCH1，5′-GTGGTGTAGAGG-CAGGCAT-3′，5′-GTGCTGGTCTCTGGTTACG-A-3′；hGLI1，5′-TCAAAGTGGGAGGCACAAAC-3′，5′-ATGGGAAGGAGGAGGACTCA-3′；hIFT88，5′-GTTATGATTGGTGCGTGGAAGT-3′，5′-GG-GCTGAGAGATTGGTTGCAG-3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少3次，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行各組間均數(shù)的比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTH參與調(diào)控軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著PTH濃度增高，PTH干預(yù)組細(xì)胞的增殖效應(yīng)隨之增高，并在100 nmol/L濃度達(dá)到峰值(圖1A)。無血清培養(yǎng)條件下軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力明顯下降，但PTH可以促進(jìn)無血清條件下的SW1353細(xì)胞增殖，而水合氯醛破壞纖毛結(jié)構(gòu)后，SW1353細(xì)胞的增殖能力進(jìn)一步降低，再加入PTH對(duì)軟骨肉瘤細(xì)胞的促增殖效應(yīng)不明顯(圖1B)。因此，我們推測(cè)PTH可能通過初始纖毛介導(dǎo)來調(diào)控軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖，這種效應(yīng)可能與纖毛的結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。

2.2 PTH參與調(diào)控軟骨肉瘤細(xì)胞的侵襲效應(yīng)

我們通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTH在不同纖毛表達(dá)水平條件下對(duì)SW1353細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，在纖毛誘導(dǎo)組中，給予PTH刺激較對(duì)照組能明顯增加穿透小室的腫瘤細(xì)胞數(shù)量，而纖毛解構(gòu)組中，PTH對(duì)腫瘤細(xì)胞的促侵襲效應(yīng)則受到抑制(圖2A、B)，表明PTH對(duì)腫瘤的促侵襲效應(yīng)可能與初始纖毛結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。與此同時(shí)，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的量來評(píng)估軟骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PTH能上調(diào)MMP9蛋白的表達(dá)，無血清誘導(dǎo)初始纖毛表達(dá)后，MMP9表達(dá)降低，而加入PTH能顯著促進(jìn)纖毛誘導(dǎo)組MMP9表達(dá)增加，而在纖毛解構(gòu)組中，PTH對(duì)MMP9的表達(dá)無明顯促進(jìn)作用(圖2C)。由此推測(cè)，PTH能促進(jìn)軟骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力，其機(jī)制可能是通過由初級(jí)纖毛介導(dǎo)的MMP9表達(dá)上調(diào)而發(fā)揮促侵襲的作用。

A：不同濃度重組人PTH(1-84)對(duì)軟骨肉瘤細(xì)胞SW1353增殖能力的影響；B：通過無血清誘導(dǎo)纖毛表達(dá)及水合氯醛破壞纖毛結(jié)構(gòu)后，重組人PTH對(duì)SW1353細(xì)胞增殖能力的影響；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與無血清組比較，#P<0.05圖1 PTH通過作用于初級(jí)纖毛促進(jìn)SW1353細(xì)胞的增殖Fig.1 PTH promotes the proliferation of SW1353 cells via the primary cilia

2.3 PTH參與調(diào)控初始纖毛的表達(dá)

PTH作為重要的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子，是PTHrP/Hedgehog負(fù)反饋環(huán)路的重要效應(yīng)分子。而初始纖毛是經(jīng)典的Hedgehog通路上游的重要組成結(jié)構(gòu)，參與調(diào)控細(xì)胞分裂周期及多種信號(hào)分子的傳導(dǎo)。我們從理論上推測(cè)，PTH可通過影響初級(jí)纖毛來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們通過熒光染色計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞初級(jí)纖毛的表達(dá)變化。如圖3所示，對(duì)照組細(xì)胞纖毛表達(dá)比例為(21.18±3.97)%，PTH組纖毛表達(dá)比例為(13.70±1.43)%；在纖毛誘導(dǎo)組(無血清)中，纖毛表達(dá)比例上升為(33.88±3.12)%，再加入PTH能下調(diào)纖毛表達(dá)至(17.35±2.54)%；而在纖毛解構(gòu)組(水合氯醛)中，纖毛表達(dá)量為(9.38±0.62)%，再給予PTH刺激也未見明顯變化，纖毛表達(dá)量為(10.33±2.67)%。因此推測(cè)PTH和纖毛表達(dá)之間存在負(fù)反饋?zhàn)饔脵C(jī)制(圖3)。

A、B：不同條件下穿透小室的軟骨肉瘤細(xì)胞數(shù)(結(jié)晶紫染色，×400)；C：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞MMP9的表達(dá)水平；與對(duì)照組比較*P<0.05；與無血清PTH組比較，#P<0.05圖2 PTH通過初級(jí)纖毛調(diào)控軟骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力Fig.2 PTH regulates the invasion of chondrosarcoma cells via primary cilia

A：通過熒光染色乙?；廖⒐艿鞍讟?biāo)記SW1353細(xì)胞表面的初始纖毛(紅色熒光)，觀察不同干預(yù)條件下初始纖毛的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，DAPI藍(lán)染細(xì)胞核(×400)；B：顯示不同條件下初始纖毛的表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與無血清組比較，#P<0.05圖3 PTH調(diào)節(jié)軟骨肉瘤細(xì)胞初始纖毛的表達(dá)水平Fig.3 PTH regulates the primary cilia expression on chondrosarcoma cells

2.4 PTH參與調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路及初始纖毛相關(guān)基因的表達(dá)

初始纖毛作為多種信號(hào)通路的重要組成部分，參與調(diào)控細(xì)胞的多種生命活動(dòng)過程，而經(jīng)典的Hedgehog通路是初始纖毛和PTH共同參與調(diào)控的信號(hào)通路。Intraflagellar轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白88(IFT88)作為重要的功能蛋白，其基因表達(dá)水平體現(xiàn)了初始纖毛的功能變化，GLI1和PTCH1基因則是Hedgehog通路的靶基因，與信號(hào)通路的激活有關(guān)。我們用RT-PCR檢測(cè)PTH在不同纖毛表達(dá)水平條件下對(duì)Hedgehog通路及IFT88基因表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，PTH對(duì)GLI1、PTCH1和IFT88基因的表達(dá)影響有限，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在纖毛誘導(dǎo)組(無血清)中，GLI1、PTCH1和IFT88基因的表達(dá)均明顯增高，再加入PTH后這種促表達(dá)效應(yīng)受到部分抑制，但仍高于對(duì)照組。而在纖毛解構(gòu)組(水合氯醛)中，3種基因的表達(dá)均受到明顯抑制，加入PTH后對(duì)基因的表達(dá)無明顯影響。

A：PTH對(duì)Hedgehog通路靶基因GLI1、PTCH1和纖毛相關(guān)基因IFT88的影響；B：無血清饑餓誘導(dǎo)纖毛表達(dá)，及再加入PTH后對(duì)目的基因表達(dá)的影響；C：水合氯醛破壞纖毛結(jié)構(gòu)后PTH對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響；*P<0.05圖4 PTH調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路及初始纖毛相關(guān)基因的表達(dá)Fig.4 PTH regulates the Hedgehog signaling pathway and the expression of genes related to the primary cilia

3 討論

PTH作為人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控骨與軟骨組織的發(fā)育過程。在正常的軟骨組織中，內(nèi)源性的PTH通過自分泌和旁分泌與受體結(jié)合，調(diào)控內(nèi)環(huán)境中鈣離子的變化，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。然而，異常的PTH表達(dá)可在體內(nèi)引起一系列代謝功能障礙，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在某些惡性腫瘤中存在PTHrP的高表達(dá)，同時(shí)與高鈣血癥密切相關(guān)，在骨腫瘤中則可伴有嚴(yán)重的溶骨性破壞[5-6]。作為一種特殊類型的骨組織腫瘤，軟骨肉瘤可以分泌軟骨樣基質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生廣泛的周圍骨組織溶骨性破壞，其惡性生物學(xué)特性，如增殖和侵襲效應(yīng)，則與腫瘤的分化程度明顯相關(guān)，雖然目前其發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但在我們的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PTH可以正向調(diào)控軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)增加提示了其對(duì)周圍組織的廣泛性破壞能力，加速對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的分解從而加速腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。因此，PTH可能在調(diào)節(jié)軟骨肉瘤的惡性生物學(xué)特性過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

同時(shí)，初始纖毛作為一種古老的細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)，其參與調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的作用不斷被再認(rèn)識(shí)和發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，正常軟骨細(xì)胞的初始纖毛表達(dá)水平較良性及惡性軟骨腫瘤而言明顯要高，而在包括軟骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞存在較低表達(dá)水平的初始纖毛[11]。由于初始纖毛能感受細(xì)胞微環(huán)境中的理化刺激，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)參與細(xì)胞周期的調(diào)控過程，纖毛表達(dá)的異常調(diào)控可能在腫瘤的異常發(fā)育過程中起著關(guān)鍵性作用，因此對(duì)初始纖毛表達(dá)調(diào)控的影響可以為我們認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)展過程提供重要的思路。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PTH可以增強(qiáng)人軟骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，同時(shí)能夠抑制初始纖毛及其功能基因IFT88的表達(dá)，而這些作用效應(yīng)又與纖毛結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。反過來纖毛誘導(dǎo)組中可能激活經(jīng)典的Hedgehog信號(hào)通路，PTH抑制纖毛表達(dá)的效應(yīng)可能導(dǎo)致Hedgehog目的基因及纖毛功能基因IFT88的表達(dá)部分下調(diào)，而破壞纖毛結(jié)構(gòu)后，Hedgehog通路和PTH的作用途徑可能均被阻斷，從而目的基因表達(dá)下調(diào)，PTH的作用效果同樣受到抑制。我們推測(cè)PTH對(duì)軟骨肉瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)特性的正向調(diào)控作用可能依賴初始纖毛的結(jié)構(gòu)和功能。因此，進(jìn)一步深入探究PTH與初始纖毛的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，將為探索軟骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

[1] Schrage Y M，Briaire-de Bruijn I H，de Miranda N F，et al.Kinome profiling of chondrosarcoma reveals src-pathway activity and dasatinib as option for treatment[J].Cancer Res，2009，69(15)：6216-6222.

[2] Bjornsson J，McLeod R A，Unni K K，et al.Primary chondrosarcoma of long bones and limb girdles[J].Cancer，1998，83(10)：2105-2119.

[3] 李繼斌，黎海芪.PTHrP信號(hào)途徑在軟骨內(nèi)成骨過程中的作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2002，22(2)：156-158.

[4] Xu K，Guo F，Zhang S，et al.Blocking Ihh signaling pathway inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of PSCs[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29(1)：39-44.

[5] Mak I W Y，Cowan R W，Turcotte R E，et al.PTHrP induces autocrine/paracrine proliferation of bone tumor cells through inhibition of apoptosis[J].PLoS One，2011，6(5)：e19975.

[6] Mak I W Y，Turcotte R E，Ghert M.Parathyroid hormone-related protein(PTHrP)modulates adhesion，migration and invasion in bone tumor cells[J].Bone，2013，55(1)：198-207.

[7] Liu B，Chen S，Cheng D，et al.Primary cilia integrate hedgehog and wnt signaling during tooth development[J].J Dent Res，2014，93(5)：475-482.

[8] Ke Y，Yang W.Primary cilium：an elaborate structure that blocks cell division?[J].Gene，2014，547(2)：175-185.

[9] Merchant J L，Saqui-Salces M.Inhibition of Hedgehog signaling in the gastrointestinal tract：Targeting the cancer microenvironment[J].Cancer Treat Rev，2014，40(1)：12-21.

[10] Nobutani K，Shimono Y，Yoshida M，et al.Absence of primary cilia in cell cycle-arrested human breast cancer cells[J].Genes Cells，2014，19(2)：141-152.

[11] Ho L，Ali S A，Aljazrawe M，et al.Primary cilia attenuate hedgehog signalling in neoplastic chondrocytes[J].Oncogene，2013，32(47)：5388-5396.

(2016-11-02 收稿)

Parathyroid Hormone Promotes the Proliferation and Invasion of ChondrosarcomaCells by Regulating the Expression of Primary Cilia

Xu Kai1#，Xiang Wei1#，Cheng Weiting2△

1DepartmentofOrthopedics，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofOncology，WuhanHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

Objective To investigate the effect of parathyroid hormone(PTH)on the proliferation and invasion of chondrosarcoma cells，and the relationship between PTH and the regulation of primary cilia expression.Methods After stimulation of the chondrosarcoma cell line SW1353 with different concentrations of PTH，induction of the expression of cilia with hypoxia and destruction of cilia structure with chloral hydrate，the cell viability was detected by CCK8 assay，the proliferation and invasion of SW1353 by Western blotting and Transwell method， the primary cilia expression by immunofluorescence assay and the GLI1，PTCH1 and IFT88 expression levels by real-time PCR.Results PTH could promote the proliferation of chondrosarcoma cells in a concentration-dependent manner and this effect was correlated with the structural integrity of the primary cilia.PTH could up-regulate the invasive ability of SW1353 cells and increase the expression levels of MMP9，which was suppressed when the primary cilia structure was damaged.Additionally，it was found that PTH could down-regulate the number of primary cilia，which was related to the structural integrity of the primary cilia.It could also regulate the expression levels of GLI1 and PTCH1，the target genes in Hedgehog pathway，and the expression levels of IFT88，the gene associated with the cilia function.Conclusion PTH can promote the proliferation and invasion of chondrosarcoma cells，down-regulate the expression of primary cilia and the downstream target genes.PTH may regulate the malignant biological features of chondrosarcoma by regulating the primary cilia expression.

parathyroid hormone； chondrosarcoma； proliferation； invasion； primary cilia

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81672652)；湖北省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.2015CFB213)

R738.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.002

#共同第一作者

許 凱，男，1979年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：godocoto@163.com

向 威，男，1989年生，博士研究生，E-mail：758687410@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：joycvt@163.com