UTP23基因在A2780/Taxol細(xì)胞中表達及對紫杉醇化療耐藥的影響

章杰捷

[摘要] 目的 探討上皮性卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞（A2780/Taxol）中UTP23基因表達水平及其對紫杉醇化療耐藥的影響。 方法 利用Real-Time PCR與Western blot分別從基因與蛋白表達水平檢測A2780/Taxol 細(xì)胞中UTP23的表達水平，通過脂質(zhì)體在A2780/Taxol 細(xì)胞中特異性瞬時過表達UTP23基因，利用MTT細(xì)胞增殖法觀察過表達UTP23基因?qū)2780/Taxol 細(xì)胞藥物敏感性的影響；通過Real-Time PCR檢測A2780/Taxol 細(xì)胞過表達UTP23后抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達水平。 結(jié)果 A2780/Taxol中UTP23的mRNA表達水平降低，約為A2780細(xì)胞的50%，UTP23蛋白表達水平下降，約為A2780細(xì)胞的48%（P<0.01）；相對于陰性轉(zhuǎn)染組，UTP23基因過表達可顯著提高A2780/Taxol 細(xì)胞中UTP23基因表達水平（P<0.05）；相對于陰性轉(zhuǎn)染組，UTP23基因過表達A2780/Taxol細(xì)胞對紫杉醇的敏感性顯著提高（P<0.01）；與陰性轉(zhuǎn)染組相比，過表達UTP23基因后A2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因表達水平顯著下降（P<0.05）。 結(jié)論 UTP23基因在A2780/Taxol細(xì)胞中低表達，可能通過促進Bcl-2基因表達，從而參與A2780/Taxol細(xì)胞的耐藥作用。

[關(guān)鍵詞] UTP23基因；紫杉醇；A2780/Taxol細(xì)胞；Bcl-2

[中圖分類號] R737.31 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）08-0086-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of UTP23 gene in paclitaxel-resistant epithelial ovarian cancer cells（A2780/Taxol） and its effect on drug resistance of paclitaxel chemotherapy. Methods Real-Time PCR and Western blot were used to detect the expression level of UTP23 in A2780/Taxol cells from the level of gene and protein expression. The UTP23 gene was transiently over-expressed in A2780/Taxol cells via liposomes. The effect of the over-expressed UTP23 gene on the drug sensitivity of A2780/Taxol cells was observed by MTT cell proliferation method. The expression of anti-apoptotic gene Bcl-2 protein after over-expression of UTP23 gene in A2780/Taxol cells was detected by Real-Time PCR. Results The expression level of UTP23 mRNA in A2780/Taxol decreased，which was about 50% of A2780 cells. And the UTP23 protein expression level decreased，which was 48% in A2780 cells（P<0.01）. Compared with negative transfection group， UTP23 gene over-expression could significantly increase the expression level of UTP23 gene in A2780/Taxol cells（P<0.05）. Compared with that in negative transfection group， the sensitivity of A2780/Taxol cells with over-expression of UTP23 gene to paclitaxel was significantly increased（P<0.01）. The expression of Bcl-2 gene after the over-expression of UTP23 gene in A2780/Taxol cells was significantly lower than that in negative transfection group（P<0.05）. Conclusion The expression of UTP23 gene is low in A2780/Taxol cells and may be involved in the drug resistance of A2780/Taxol cells by promoting the expression of Bcl-2 gene.

[Key words] UTP23 gene； Paclitaxel； A2780/Taxol cells； Bcl-2

上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌，位居女性生殖系統(tǒng)癌癥死亡率榜首，由于缺乏早期臨床癥狀及特異的早期診斷標(biāo)志物，大部分患者確診時已是腫瘤晚期階段，嚴(yán)重威脅著女性患者的生存[1]。目前，臨床手術(shù)及術(shù)后紫杉醇等化療藥物的聯(lián)合治療，一部分患者初步有效，然而，大部分患者往往由于化療藥物耐藥性的產(chǎn)生，最終死亡[2]。大量研究表明，逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥將有助于改善患者預(yù)后[3]。UTP23是一種核仁蛋白，與90S前核糖體顆粒相互連接，參與18S rRNA的A0、A1及A2早期位點修飾，核糖體是蛋白質(zhì)合成的重要組成部分，rRNA直接調(diào)控蛋白合成的過程[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)UTP23在多重耐藥的腫瘤中呈現(xiàn)異常表達，并且與腫瘤的耐藥密切相關(guān)[5]。本研究旨在探討UTP23在上皮性卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞中的表達及其與耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

上皮性卵巢癌細(xì)胞株A2780與上皮性卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株A2780/Taxol均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，均使用含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2 實驗材料

胎牛血清購自Gibco公司，噻唑藍（MTT）、RPMI1640培養(yǎng)液、紫杉醇均購自Sigma公司，BCA蛋白濃度測定盒購自碧云天生物技術(shù)公司，兔抗人UTP23抗體、兔抗人Bcl-2抗體、抗GAPDH抗體及相對應(yīng)的二抗均購自美國Abcam公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、陰性對照轉(zhuǎn)染試劑購自Santa Cruz公司，qRT-PCR試劑盒購自Takara公司。

1.3 RT-PCR測定UTP23基因表達

取對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞與A2780/Taxol細(xì)胞，使用Trazol裂解液提取細(xì)胞總RNA，按照Takara公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，進行UTP23基因擴增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s 40個循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt方法分別計算A2780細(xì)胞與A2780/Taxol細(xì)胞UTP23基因的相對表達量，重復(fù)3次實驗。

1.4 Western blot蛋白印跡法測定UTP23蛋白表達水平

取對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞與A2780/Taxol細(xì)胞，棄去細(xì)胞上清培養(yǎng)液，使用蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白后，BCA法進行蛋白定量檢測蛋白濃度，以相同的作蛋白上樣總量，進行凝膠蛋白電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至預(yù)處理的硝酸纖維素膜，用5%濃度的脫脂牛奶封閉60 min，一抗孵育UTP23抗體（1∶100）、GAPDH抗體（1∶1000）4℃過夜。TBST溶液洗滌5次，每次3 min，加入相對應(yīng)的二抗（1∶1000）室溫孵育60 min。洗滌后加入化學(xué)發(fā)光液，進行曝光成像。

1.5 脂質(zhì)體過表達UTP23基因與陰性對照

將A2780/Taxol細(xì)胞以3×105/孔接種于六孔板，含有10%胎牛血清完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育至大約融合狀態(tài)，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將陰性對照轉(zhuǎn)染試劑及UTP23基因與脂質(zhì)體混合后，加入A2780/Taxol細(xì)胞中，在37℃、5%CO2恒溫箱繼續(xù)孵育48 h。

1.6 MTT細(xì)胞增殖法觀察UTP23基因?qū)2780/Taxol細(xì)胞耐藥的影響

空白對照組（A2780/Taxol細(xì)胞）、陰性轉(zhuǎn)染組（陰性轉(zhuǎn)染A2780/Taxol細(xì)胞）與UTP23過表達組（過表達UTP23 基因A2780/Taxol細(xì)胞），以相同的細(xì)胞密度接種于96孔板，每組五個復(fù)孔，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)24 h。分別加入紫杉醇（分別加入10、50、250、1250 nmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/mL的MTT培養(yǎng)液恒溫孵育6 h，吸取上層細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，加入100 μL DMSO完全溶解結(jié)晶，570 nm波長處測定吸光度值（A）。

1.7 RT-PCR法檢測UTP23基因?qū)2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因表達的影響

提取空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組及過表達組細(xì)胞RNA，選取對數(shù)生長期A2780/Taxol細(xì)胞、陰性轉(zhuǎn)染A2780/Taxol細(xì)胞與過表達UTP23 基因A2780/Taxol細(xì)胞，如方法1.3提取RNA、合成cDNA，進行Bcl-2基因擴增，以GAPDH作為內(nèi)參，Bcl-2引物上游5-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3下游5- GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3。實驗條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，進行40個循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt方法分別計算三組細(xì)胞UTP23基因的相對表達量，重復(fù)3次實驗。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A2780/Taxol細(xì)胞中UTP23基因的mRNA表達水平

通過RT-PCR檢測A2780/Taxol細(xì)胞與A2780細(xì)胞中UTP23基因的mRNA表達水平，結(jié)果顯示，A2780/Taxol細(xì)胞中UTP23的mRNA表達水平顯著減少，約為A2780細(xì)胞的50%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖1）。

2.2 A2780/Taxol細(xì)胞中UTP23基因的蛋白表達水平

如圖2所示，Western blot檢測A2780/Taxol細(xì)胞與A2780細(xì)胞中UTP23基因的蛋白表達水平，如圖2A所示，UTP23蛋白在A2780/Taxol細(xì)胞中表達水平顯著下調(diào)，約為A2780細(xì)胞的48%，A2780/Taxol細(xì)胞與A2780細(xì)胞UTP23蛋白表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖2B）。

2.3 A2780/Taxol細(xì)胞過表達UTP23基因

通過RT-PCR分別檢測空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組與UTP23過表達組的A2780/Taxol細(xì)胞UTP23基因mRNA表達水平，如圖3所示，UTP23過表達的A2780/Taxol細(xì)胞UTP23 mRNA表達水平顯著提高，約為陰性轉(zhuǎn)染組的3.5倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而空白對照組與陰性轉(zhuǎn)染組的A2780/Taxol細(xì)胞UTP23的mRNA表達水平相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明UTP23基因過表達轉(zhuǎn)染有效。

2.4 UTP23基因?qū)2780/Taxol細(xì)胞耐藥的影響

通過MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UTP23基因過表達的A2780/Taxol細(xì)胞對紫杉醇的敏感性顯著增加，相對于陰性轉(zhuǎn)染A2780/Taxol細(xì)胞，當(dāng)紫杉醇濃度為250 nmol/L時，UTP23基因過表達的A2780/Taxol細(xì)胞增殖受到抑制（P<0.05），當(dāng)紫杉醇濃度達1250 nmol/L時，紫杉醇對UTP23基因過表達的A2780/Taxol細(xì)胞的殺傷最為顯著（P<0.01），而空白對照組與陰性轉(zhuǎn)染組A2780/Taxol細(xì)胞增殖比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。

2.5 UTP23基因?qū)2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因表達的影響

通過RT-PCR檢測UTP23基因?qū)2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因表達水平的影響，如圖5所示，與陰性轉(zhuǎn)染組的A2780/Taxol細(xì)胞相比，UTP23基因過表達組的A2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因的表達水平顯著下降（P<0.05），而空白對照組與陰性轉(zhuǎn)染組A2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因的表達水平相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

上皮性卵巢癌是女性三大生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，死亡率占女性生殖系統(tǒng)腫瘤的第1位，雖然手術(shù)聯(lián)合化療的治療水平提高，但由于腫瘤對化療藥物耐藥性的產(chǎn)生，患者往往出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，腫瘤遠端轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率僅25%左右[6-9]。目前，臨床紫杉醇是殺傷上皮性卵巢癌細(xì)胞的一線化療藥物，長時間應(yīng)用，上皮性卵巢癌耐受紫杉醇，藥物敏感度大大降低，嚴(yán)重影響治療效果，是患者治療過程死亡的最常見原因。但上皮性卵巢癌對紫杉醇耐藥的關(guān)鍵分子與具體機制仍然不清楚。因此，如何逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥成為治療上皮性卵巢癌的難點，得到人們的廣泛關(guān)注[10]。

UTP23基因是新發(fā)現(xiàn)的一種小亞基組成部分，參與核糖體的成熟。早期研究顯示UTP23可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在結(jié)直腸癌中通過基因與環(huán)境的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析表達發(fā)現(xiàn)，位于8q23.3染色體的易感基因與UTP23表達高度相同的基因，與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[11]。近來，研究發(fā)現(xiàn)UTP23在上皮性卵巢癌化療耐受患者癌組織表達顯著低于化療敏感患者，此外，UTP23低表達與患者的不良預(yù)后呈相關(guān)性，提示UTP23可能在上皮性卵巢癌產(chǎn)生耐藥中發(fā)揮重要的作用，然而，其具體分子機制仍不清楚[12，13]。因此，本文選取上皮性卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞對UTP23基因表達及其在耐藥中的作用進行探討。

通過RT-PCR檢測A2780細(xì)胞與A2780/Taxol細(xì)胞UTP23基因表達水平顯示，A2780/Taxol細(xì)胞中UTP23基因呈現(xiàn)下調(diào)模式，Western blot從蛋白水平驗證A2780/Taxol細(xì)胞中UTP23蛋白表達顯著減少，分別從基因與蛋白水平驗證UTP23在A2780/Taxol細(xì)胞表達減少，與早期報道一致，提示UTP23在上皮性卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞中可能參與耐藥的產(chǎn)生。利用脂質(zhì)體過表達UTP23基因后發(fā)現(xiàn)A2780/Taxol細(xì)胞對紫杉醇的敏感性顯著提高，提示UTP23基因可促進紫杉醇對A2780/Taxol細(xì)胞的殺傷作用，減少耐藥性。

研究報道卵巢癌耐藥性產(chǎn)生有多種機制，不同化療藥物產(chǎn)生耐藥性的具體機制亦不同。臨床傳統(tǒng)藥物順鉑、阿霉素等主要通過促進多藥耐藥基因表達，從而導(dǎo)致卵巢癌產(chǎn)生耐藥治療失?。宦殉舶┘?xì)胞中谷胱甘肽及其轉(zhuǎn)移酶的表達增多，促進環(huán)磷酰胺及紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生[14-17]。此外，早期的研究在卵巢癌患者組織發(fā)現(xiàn)Bcl-2抗凋亡基因表達上調(diào)，與卵巢癌患者化療藥物耐受顯著相關(guān)；Bcl-2是凋亡調(diào)控家族中重要的抗凋亡基因，主要通過促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，從而促進腫瘤細(xì)胞的不斷生長，對藥物產(chǎn)生耐藥性[18-20]。本研究RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達UTP23基因后A2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因表達水平顯著下降，提示UTP23可能通過抑制A2780/Taxol細(xì)胞Bcl-2基因表達，從而抑制細(xì)胞增殖，增加A2780/Taxol細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UTP23基因在A2780/Taxol細(xì)胞表達減少，過表達UTP23基因可下調(diào)Bcl-2抗凋亡基因表達，促進A2780/Taxol細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，減少耐藥性的產(chǎn)生，可部分逆轉(zhuǎn)A2780/Taxol細(xì)胞對紫杉醇的耐藥。UTP23基因調(diào)控A2780/Taxol細(xì)胞耐藥的具體分子機制及胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，有待更進一步研究。

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