神香草不同洗脫物對豚鼠離體氣管平滑肌收縮的影響Δ

袁鳳娟，孫玉華，哈木拉提·哈斯木，王新堂，賀金華#，毛 艷（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830054；.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004）

·民族醫(yī)藥·

神香草不同洗脫物對豚鼠離體氣管平滑肌收縮的影響Δ

袁鳳娟1，2＊，孫玉華2，哈木拉提·哈斯木2，王新堂2，賀金華2#，毛 艷2（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004）

目的：考察維藥神香草不同洗脫物對豚鼠離體支氣管平滑肌收縮的影響。方法：制備豚鼠離體氣管環(huán)后浸泡于克-亨液中，以乙酰膽堿（ACh，1×10－7g/m L）或組胺（His，1×10－6g/m L）致氣管環(huán)收縮，然后分別考察質(zhì)量濃度為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mg/m L的神香草水洗脫物和30%、50%、60%、70%、95%的乙醇洗脫物對氣管環(huán)收縮的影響，記錄收縮曲線并計算解痙率；試驗均以生理鹽水為空白對照，以氨茶堿（0.08mg/m L）為陽性對照。結(jié)果：與空白對照比較，0.16～2.56mg/m L的30%、50%乙醇洗脫物，0.32～2.56mg/m L的60%乙醇洗脫物以及0.64～2.56mg/m L的70%、95%乙醇洗脫物均可明顯抑制ACh致氣管環(huán)收縮，解痙率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；0.32～2.56mg/m L的水洗脫物和30%、50%乙醇洗脫物，0.16～2.56mg/m L的60%、70%乙醇洗脫物以及1.28～2.56mg/m L的95%乙醇洗脫物可明顯抑制His致氣管環(huán)收縮，解痙率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；其中2.56mg/m L的60%乙醇洗脫物作用效果與氨茶堿接近。結(jié)論：神香草不同洗脫物對ACh或His致豚鼠離體支氣管平滑肌收縮均有一定的抑制作用；其中以60%乙醇洗脫物作用最強，其在高質(zhì)量濃度下作用與氨茶堿相當(dāng)。

神香草；洗脫物；離體氣管；乙酰膽堿；組胺；豚鼠

支氣管哮喘（Bronchialasthma，簡稱“哮喘”）具有可逆性支氣管收縮、氣流阻塞等特征，當(dāng)哮喘發(fā)作時，患者發(fā)生氣道反應(yīng)性狹窄甚至閉塞，嚴重呼吸困難，致使氣道功能降低[1-2]。研究表明，哮喘患者膽堿能神經(jīng)功能亢進，發(fā)作時組胺H1受體數(shù)量增多[3]。目前多采用激素（糖皮質(zhì)激素）、β2受體激動藥、茶堿、抗膽堿藥等緩解哮喘癥狀，但長期服用這類藥物可產(chǎn)生許多副作用，如肥胖、自發(fā)性骨折、心率失常等[4]。因此，開發(fā)低毒、副作用較小的藥物并闡明其作用機制具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。

神香草為唇形科植物硬尖神香草（Hyssopus cuspidatus Boriss.）的干燥地上部分[5]，維吾爾名為“祖帕奇尼”，其性質(zhì)干熱，全草入藥，主要含有揮發(fā)油、黃酮、生物堿等化學(xué)成分，具有解除支氣管痙攣、鎮(zhèn)咳、祛痰的藥理作用。維吾爾族用神香草治療氣管炎已有百年的歷史，且療效顯著[6-7]，以神香草為主藥的寒喘祖帕顆粒已被收載于《維吾爾藥分冊》中[8]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對神香草的報道主要集中在抗衰老、降糖、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等方面[9]，對其舒張支氣管方面報道較少。為進一步考察神香草對支氣管的舒張作用，筆者考察不同洗脫物對乙酰膽堿（ACh）和組胺（His）引發(fā)的支氣管收縮的影響。

1 材料

1.1 儀器

BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)、HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)和HW-1000超級恒溫水浴系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 藥材與試劑

神香草采自阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為唇形科植物硬尖神香草的干燥地上部分；ACh、His（美國Sigma公司，批號：BCBM 4814V、WXBB2337V，純度：≥99.0%）；氨茶堿注射液（以下簡稱氨茶堿，常州蘭陵制藥有限公司，批號：11409051，規(guī)格：25mg/m L）。

1.3 動物

豚鼠12只，♀（無孕）♂各半，體質(zhì)量為350～400 g，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，動物合格證號：65000200000477。豚鼠飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所SPF級動物房內(nèi)，室溫為（24±1）℃、通風(fēng)良好，飼養(yǎng)期間自由飲食。

2 方法

2.1 神香草不同洗脫物的制備

取神香草干燥地上部分30 kg，粉碎成寸段，用12倍量水加熱回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至適當(dāng)濃度，上樣于聚酰胺樹脂。分別用水和30%、50%、60%、70%、95%乙醇進行洗脫，收集相應(yīng)洗脫液，濃縮后置于真空干燥箱中干燥，得各洗脫物干燥浸膏。其收率分別為：水洗脫物，23.05%；30%乙醇洗脫物，14.57%；50%乙醇洗脫物，14.12%；60%乙醇洗脫物，10.04%；70%乙醇洗脫物，8.01%；95%乙醇洗脫物，5.24%。

2.2 豚鼠離體氣管環(huán)的制備

將豚鼠ip戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉，腹面正中切開頸部皮膚和皮下組織，細心分離出氣管，自甲狀腺軟骨至氣管分叉處剪下全部氣管，放入盛有預(yù)先用混合氣體（95%O2和5%CO2）飽和的克-亨液（Krebs-Henseleit）的培養(yǎng)皿中，去除氣管周圍的結(jié)締組織，然后在氣管的腹面（軟骨環(huán)面）將氣管剪成3～5mm的氣管環(huán)，將氣管環(huán)置于盛有10m L克-亨液的恒溫套瓶中，并持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，維持套瓶溫度為（37± 0.5）℃、pH為7.4。每根氣管環(huán)用2個三角形掛鉤貫穿其管腔，一端固定，另一端接于張力傳感器，張力變化由BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)采集并記錄。調(diào)節(jié)初始張力為1.5 g左右，穩(wěn)定60m in，氣管環(huán)初始張力穩(wěn)定過程中每30min更換一次預(yù)溫至37℃的克-亨液[10]。

2.3 ACh、His致豚鼠氣管平滑肌收縮的濃度篩選

向制備好的氣管環(huán)中加入質(zhì)量濃度分別為1×10－11、1×10－10、1×10－9、1×10－8、1×10－7g/m L的ACh溶液或質(zhì)量濃度分別為1×10－11、1×10－10、1×10－9、1×10－8、1×10－7、1× 10－6g/m L的His溶液，與氣管環(huán)接觸5min，待張力曲線上升至最明顯處，氣管收縮達到穩(wěn)定值時，觀察曲線上升幅度。記錄氣管環(huán)收縮曲線，并計算氣管收縮率[收縮率（%）＝（收縮前曲線高度－收縮后曲線高度）/收縮前曲線高度×100%]，實驗共重復(fù)8次。

2.4 神香草不同洗脫物對ACh致豚鼠氣管平滑肌收縮的舒張作用考察

按“2.1”項下方法制備豚鼠離體氣管環(huán)，等基線平穩(wěn)后向10m L浴槽中加入ACh（1×10－7g/m L），待張力曲線上升至最明顯處（即氣管收縮達到高峰時）穩(wěn)定15m in，然后分別加入質(zhì)量濃度為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mg/m L（以浸膏計）的神香草不同洗脫物，并另設(shè)加入生理鹽水的空白對照以及加入氨茶堿（0.08mg/m L）的陽性對照。每加一種藥物，接觸5min，觀察曲線下降幅度、氣管松弛情況，記錄氣管環(huán)收縮曲線，并計算解痙率[解痙率（%）＝（給藥前曲線高度－給藥后曲線高度）/給藥前曲線高度×100%]，實驗共重復(fù)8次。

2.5 神香草不同洗脫物對His致豚鼠氣管平滑肌收縮的舒張作用考察

按“2.1”項下方法制備豚鼠離體氣管環(huán)，等基線平穩(wěn)后，向10m L浴槽中加入His（1×10－6g/m L），待張力曲線上升至最明顯處（即氣管收縮達到高峰時）穩(wěn)定15m in，然后分別加入質(zhì)量濃度為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mg/m L（以浸膏計）的神香草不同洗脫物，并另設(shè)加入生理鹽水的空白對照和加入氨茶堿（0.08mg/m L）的陽性對照。每加一種藥物，接觸5min，觀察曲線下降幅度、氣管松弛情況，記錄氣管環(huán)收縮曲線，并計算解痙率（計算公式同“2.4”項下），實驗共重復(fù)8次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ACh、His致豚鼠離體氣管環(huán)收縮的濃度篩選結(jié)果

ACh和His能夠較好地引起豚鼠離體氣管環(huán)的收縮，ACh在用量為1×10－7g/m L時能夠較明顯地收縮氣管，同質(zhì)量濃度下His的敏感度弱于ACh，但His在質(zhì)量濃度為1×10－6g/m L時對支氣管的收縮作用與1×10－7g/m LACh相當(dāng)，結(jié)果見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度ACh和His作用后氣管收縮率測定結(jié)果（±s，n＝8，%%）Tab 1 Determ ination results of tracheal contraction rate after treated w ith ACh and H is of different concentrations（±s，n＝8，%%）

表1 不同質(zhì)量濃度ACh和His作用后氣管收縮率測定結(jié)果（±s，n＝8，%%）Tab 1 Determ ination results of tracheal contraction rate after treated w ith ACh and H is of different concentrations（±s，n＝8，%%）

樣品ACh His質(zhì)量濃度，g/mL 1×10－1120.22±11.7 9.00±6.90 1×10－1033.13±17.16 18.91±10.33 1×10－941.06±15.11 29.61±12.51 1×10－850.97±13.43 41.60±13.02 1×10－760.25±14.25 53.97±9.59 1×10－663.04±11.44

3.2 神香草不同洗脫物對ACh致豚鼠氣管平滑肌收縮的舒張作用考察結(jié)果

神香草不同洗脫物均能不同程度地抑制1×10－7g/m LACh引起的豚鼠離體氣管環(huán)收縮，且呈濃度依賴性。與空白對照比較，0.16～2.56mg/m L的30%、50%乙醇洗脫物，0.32～2.56mg/m L的60%乙醇洗脫物以及0.64～2.56mg/m L的70%、95%乙醇洗脫物均可明顯抑制ACh致氣管環(huán)收縮，解痙率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且2.56mg/m L的60%乙醇洗脫物的作用效果最為顯著，與氨茶堿接近，詳見表2。

表2 神香草不同洗脫物對ACh致氣管收縮的解痙率測定結(jié)果（±s，n＝8，%%）Tab 2 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on ACh-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

表2 神香草不同洗脫物對ACh致氣管收縮的解痙率測定結(jié)果（±s，n＝8，%%）Tab 2 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on ACh-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

注：空白對照解痙率為（3.84±1.62）%，陽性對照解痙率為（54.15±7.98）%；與空白對照比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：the antispasmodic rate of blank control is（3.84±1.62）%，the antispasmodic rate of positive control is（54.15±7.98）%；vs.blank control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

樣品水洗脫物30%乙醇洗脫物50%乙醇洗脫物60%乙醇洗脫物70%乙醇洗脫物95%乙醇洗脫物質(zhì)量濃度，mg/mL 0.08 2.98±0.98 4.78±3.2 4.57±3.07 1.08±0.25＊3.07±3.05 2.87±2.03 0.16 3.35±3.13 9.70±0.15＊＊10.08±2.89＊8.74±2.89 5.14±3.51 6.78±4.57 0.32 7.14±2.73 14.06±3.46＊＊18.12±6.13＊＊15.46±4.55＊10.25±4.96 11.89±5.84 0.64 8.57±2.67＊19.12±7.93＊23.36±8.238＊23.46±12.13＊16.99±8.27＊14.14±4.17＊1.28 9.51±4.06＊30.51±5.08＊＊31.27±6.29＊＊34.74±18.02＊26.76±9.66＊＊19.64±2.64＊＊2.56 10.88±5.21＊38.93±2.85＊＊37.48±7.70＊＊52.43±7.97＊＊33.10±10.77＊＊26.31±3.36＊＊

3.3 神香草不同洗脫物對His致豚鼠氣管平滑肌收縮的舒張作用考察結(jié)果

神香草不同洗脫物均能不同程度地抑制1×10－6g/m LHis引起的豚鼠離體氣管環(huán)收縮，且具有濃度依賴性。0.32～2.56mg/m L的水洗脫物和30%、50%乙醇洗脫物，0.16～2.56mg/m L的60%、70%乙醇洗脫物以及1.28～2.56mg/m L的95%乙醇洗脫物可明顯抑制His致氣管環(huán)收縮，解痙率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；其中以2.56mg/m L的60%洗脫物作用效果最為顯著，與氨茶堿接近，詳見表3。

表3 神香草不同洗脫物對His致氣管收縮的解痙率測定結(jié)果（±s，n＝8，%%）Tab 3 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on His-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

表3 神香草不同洗脫物對His致氣管收縮的解痙率測定結(jié)果（±s，n＝8，%%）Tab 3 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on His-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

注：空白對照解痙率為（3.84±1.62）%，陽性對照解痙率為（54.15±7.98）%；與空白對照比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：the antispasmodic rate of blank control is（3.84±1.62）%，the antispasmodic rate of positive control is（54.15±7.98）%；vs.blank control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

樣品水洗脫物30%乙醇洗脫物50%乙醇洗脫物60%乙醇洗脫物70%乙醇洗脫物95%乙醇洗脫物質(zhì)量濃度，mg/mL 0.08 9.83±5.04 8.43±6.87 13.69±8.17 22.57±8.32 13.02±6.16 17.70±12.01 0.16 21.26±8.22 20.22±13.40 22.67±8.12 35.74±10.55＊＊21.03±4.93＊22.91±13.69 0.32 24.17±4.72＊26.54±11.20＊31.26±6.43＊＊41.27±10.58＊＊26.34±7.24＊25.70±16.32 0.64 25.68±6.52＊32.95±9.77＊＊38.10±10.57＊＊47.05±9.03＊＊32.46±10.39＊26.33±23.10 1.28 30.88±6.88＊＊36.82±9.74＊＊41.88±10.22＊＊58.19±11.60＊＊35.71±17.62＊33.37±9.92＊＊2.56 35.00±7.42＊＊40.54±10.70＊＊49.27±10.01＊＊65.83±12.03＊＊40.91±21.34＊39.34±9.16＊＊

4 討論

豚鼠離體氣管實驗是評價抗哮喘藥物的常用方法，本研究采用豚鼠離體氣管環(huán)，可以直接觀察受試藥物對氣管平滑肌收縮的抑制作用；然后用生物機能實驗系統(tǒng)記錄支氣管平滑肌收縮與舒張時的張力曲線，方法簡單可行，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。氨茶堿是一種治療哮喘“物美價廉”的藥品，其血藥濃度在10～20mg/L時具有良好的舒張支氣管作用[11]。筆者前期預(yù)實驗結(jié)果顯示，氨茶堿質(zhì)量濃度為0.08mg/m L時解痙效果明顯，故本研究以0.08mg/m L氨茶堿為陽性對照。

影響支氣管平滑肌張力的主要因素有神經(jīng)反射、鉀離子通道的開放狀態(tài)、信號傳遞的通路以及支氣管平滑肌上受體的狀態(tài)等[12]。當(dāng)哮喘患者哮喘發(fā)作時，支氣管平滑肌上炎癥細胞破裂，產(chǎn)生大量ACh，從而激動氣管平滑肌M受體；并且組胺H1受體數(shù)量增加，有50%的氣管收縮是由His介導(dǎo)[13-14]?？梢姡珹Ch和His是哮喘急性發(fā)作期導(dǎo)致氣管痙攣收縮的2種主要介質(zhì)。ACh作用于M膽堿受體，His作用于H1受體，從而致使支氣管平滑肌收縮，引起支氣管痙攣，最終導(dǎo)致呼吸困難，而拮抗ACh、His可以延緩哮喘的發(fā)病[15]。本研究結(jié)果顯示，神香草不同洗脫物均能不同程度地抑制ACh和His引起的豚鼠離體氣管環(huán)收縮，且以神香草60%洗脫物作用效果最明顯，當(dāng)其質(zhì)量濃度為2.56mg/m L時，對氣管收縮的抑制作用與陽性對照氨茶堿相當(dāng)。

綜上所述，神香草60%洗脫物能夠顯著抑制ACh和His導(dǎo)致的支氣管平滑肌收縮，緩解支氣管痙攣。本研究為后期考察神香草60%洗脫物是否通過拮抗M膽堿受體和H1受體進而抑制支氣管痙攣的作用機制研究奠定了基礎(chǔ)。

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Effects of the Different Elutions of Hyssopus cuspidatus on Smooth M uscle Contraction of Isolated Tracheal in Guinea Pigs

YUAN Fengjuan1，2，SUN Yuhua2，HAMULATI·Hasimu2，WANG Xintang2，HE Jinhua2，MAO Yan2（1.Xinjiang Medical University Institute of TCM，Urumqi 830054，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Materia Medical，Urumqi 830004，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of different elutions of Hyssopus cuspidatus on smooth muscle contraction of isolated tracheal in Guinea pigs.METHODS：Isolated tracheal rings were prepared and soaked in Krebs-Henseleit，using acetylcholine（ACh，1×10－7g/m L）or histam ine（His，1×10－6g/m L）to induce contraction of tracheal rings，then the effects of H.cuspidatus water elution and 30%，50%，60%，70%，95%ethanol elutionsw ith mass concentrations of 0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56 mg/m L on contraction of tracheal rings were respectively investigated.Contraction curves were recorded and antispasmodic rates were calculated.Tests were treated w ith saline as blank control and am inophylline（0.08 mg/m L）as positive control.RESULTS：Compared w ith blank control，0.16-2.56 mg/m L 30%，50%ethanol elution，0.32-2.56 mg/m L 60%ethanol elution and0.64-2.56 mg/m L 70%，95%ethanol elution can obviously inhibit ACh-induced contraction of tracheal rings，antispasmodic rates were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）；0.32-2.56mg/m L water elution and 30%，50%ethanol elution，0.16-2.56mg/m L 60%，70%ethanol elution and 1.28-2.56 mg/m L 95%ethanol elution can obviously inhibit His-induced contraction of tracheal rings，antispasmodic rates were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）.The effects of 2.56 mg/m L 60%ethanol elution approach to am inophylline.CONCLUSIONS：Different elutions of H.cuspidatus has certain antagonistic effect on the ACh-induced or His-induced smooth muscle contraction of isolated tracheal in Guinea pigs；60%ethanol elution shows the strongest effect，which has similar effectsw ith aminophylline at highmass concentration.

Hyssopus cuspidatus；Elution；Isolated tracheal；Acetylcholine；Histamine；Guinea pigs

R965.1

A

1001-0408（2017）13-1790-04

2016-08-23

2016-12-15）

（編輯：林 靜）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81560644）；新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥科技人才培養(yǎng)項目（No.2016-03-03）；新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目（No.201417017）；新疆醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（No.CXCY 070）

＊碩士研究生。研究方向：心血管藥理。電話：0991-2320296。E-mail：yfj1231_xj@163.com

#通信作者：研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向：維吾爾藥有效成分分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。電話：0991-2326572。E-mail：hejh1216@163. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.18