UPLC-MS/MS法快速篩查抗風(fēng)濕類中藥貼劑中非法添加的17種化學(xué)藥物成分Δ

李 強(qiáng)，岳 磊，李曉靜（1.河南省食品藥品審評查驗中心，鄭州 450018；鄭州市食品藥品檢驗所，鄭州450015；3.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 45005）

UPLC-MS/MS法快速篩查抗風(fēng)濕類中藥貼劑中非法添加的17種化學(xué)藥物成分Δ

李 強(qiáng)1＊，岳 磊2，李曉靜3#（1.河南省食品藥品審評查驗中心，鄭州 450018；2鄭州市食品藥品檢驗所，鄭州450015；3.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052）

目的：建立快速篩查抗風(fēng)濕類中藥貼劑中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素和8種非甾體抗炎藥物成分的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。色譜條件：色譜柱Acquity UPLC?BEN C18，流動相為甲醇-水（90∶10，V/V），流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ，進(jìn)樣量為1 μL；質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，噴霧針電壓為5 500 V，離子源噴霧氣GS1、GS2分別為50、50 psi，離子源溫度為500 ，掃描范圍為m/z 50～550，檢測方式為正負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）聯(lián)合相關(guān)信息掃描（IDA）和增強(qiáng)離子掃描（EPI）模式。結(jié)果：17種化學(xué)藥物成分檢測限均≤0.400 μg/mL。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗的RSD分別≤4.93%、7.69%、9.57%。實測樣品中可檢出雙氯芬酸鈉。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，適用于抗風(fēng)濕類中藥貼劑中非法添加化學(xué)藥物成分的定性分析。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；多反應(yīng)監(jiān)測；抗風(fēng)濕類中藥貼劑；非法添加；糖皮質(zhì)激素；非甾體抗炎藥

隨著國家經(jīng)濟(jì)及互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的發(fā)展，以電商為主的網(wǎng)絡(luò)銷售平臺開始出現(xiàn)各種名目繁多的中藥，抗風(fēng)濕類中藥貼劑因使用方便、療效獨特、不良反應(yīng)小而廣受患者歡迎；但多數(shù)顯效慢，需長期使用，不法分子利用患者求治心切，為凸顯產(chǎn)品療效，非法添加功能性化學(xué)藥品的現(xiàn)象非常普遍[1]，且所添加的化學(xué)藥種類也逐年增多[2-4]?？癸L(fēng)濕類中藥非法添加物檢測現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補(bǔ)充檢驗方法和檢驗項目批準(zhǔn)件（編號：2009025），該標(biāo)準(zhǔn)主要針對雙氯芬酸鈉、對乙酰氨基酚等非甾體抗炎藥進(jìn)行篩查，對于濫用危害性更大的糖皮質(zhì)激素類藥物僅有氫化可的松、醋酸潑尼松和地塞米松3種，尚不能滿足日常檢驗的需求[5]。而藥品檢測前處理僅針對片劑、膠囊劑及大蜜丸進(jìn)行了簡單描述，對貼劑等尚無前處理操作標(biāo)準(zhǔn)。

抗風(fēng)濕類中藥中非法添加物的檢測方法有薄層色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10-11]等，本課題組采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/ MS）技術(shù)，使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）聯(lián)合相關(guān)信息掃描（IDA）、增強(qiáng)離子掃描（EPI）的方式，建立了同時檢測抗風(fēng)濕類中藥貼劑中17種抗炎類化學(xué)藥物成分（包括9種糖皮質(zhì)激素和8種非甾體抗炎藥）的快速檢驗方法；其中，新增糖皮質(zhì)激素類藥物成分6種，檢測效率得到提高。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC儀（美國Waters公司）；4000QTrap型MS儀（美國SCIEX公司）；HU10300/40B型超聲波清洗機(jī)（上海楚定分析儀器有限公司，功率：300 W，頻率：40 kHz）。

1.2 試劑

實測樣品來自鄭州市食品藥品監(jiān)督管理局抽檢樣品（A公司，批號：150523-177，規(guī)格：100 mm×70 mm）；氫化可的松對照品（批號：100152-200206，純度：100.0%）、醋酸可的松對照品（批號：100123-201204，純度：99.2%）、地塞米松對照品（批號：100129-201506，純度：99.7%）、醋酸潑尼松對照品（批號：100012-201407，純度：99.7%）、醋酸潑尼松龍對照品（批號：100124-201104，純度：99.2%）、醋酸氟輕松對照品（批號：100010-201108，純度：99.6%）、丙酸倍氯米松對照品（批號：100119-201504，純度：99.0%）、倍他米松對照品（批號：100118-201204，純度：100.0%）、糠酸莫米松對照品（批號：100930-201201，純度：99.9%）、氨基比林對照品（批號：100503-201302，純度：99.9%）、布洛芬對照品（批號：100179-201406，純度：98.8%）、雙氯芬酸鈉對照品（批號：100324-200302，純度：100.0%）、吲哚美辛對照品（批號：100258-200904，純度：99.9%）、對乙酰氨基酚對照品（批號：100018-201409，純度：100.0%）、吡羅昔康對照品（批號：100177-200603，純度：99.8%）、萘普生對照品（批號：100198-201205，純度：99.9%）、保泰松對照品（批號：100481-200601，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙酸銨、乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC?BEN C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇-水（90∶10，V/V）；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ；進(jìn)樣量：1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：正負(fù)離子模式；MRM聯(lián)合IDA和EPI模式；噴霧針電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：500 ；離子源噴霧氣（GS1、GS2）：50、50 psi；掃描范圍：m/z 50～550。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取各待測成分對照品各約10 mg，精密稱定，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得單一對照品貯備液。精密量取上述各單一對照品貯備液1.00 mL，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，制成單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品1次用量，撕開不粘層，展開，貼在定量濾紙上，用剪刀裁去多余濾紙，再將樣品裁剪成小片，置于50 mL燒杯中，加甲醇適量，超聲處理30 min，濾過，續(xù)濾液放冷至室溫，精密量取1.00 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 空白對照溶液 取空白貼劑1份，按“2.2.2”項下方法操作，制成空白對照溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液各適量，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1、圖2。結(jié)果顯示，空白貼劑（圖略）及前處理中涉及到的相關(guān)物質(zhì)對目標(biāo)物的測定不產(chǎn)生干擾，方法專屬性強(qiáng)。

2.4 檢測限考察

精密量取“2.2.1”項下對照品溶液各適量，倍比稀釋，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表1。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液各適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，各待測成分峰面積的RSD為0.88%～4.93%（n＝6），表明儀器精密度良好，詳見表1。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：150523-177）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，各待測成分峰面積的RSD為5.97%～9.57%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，詳見表1。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：150523-177）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，各待測成分峰面積的RSD為1.81%～7.69%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好，詳見表1。

2.8 樣品中化學(xué)藥物成分檢測結(jié)果

若供試品出現(xiàn)與某對照品所有選擇離子對質(zhì)量數(shù)（見表1）、色譜峰保留時間一致，且兩個選擇離子峰高比與對照品一致，則確認(rèn)供試品中添加相應(yīng)的對照品成分。如上述指標(biāo)不能完全確認(rèn)檢出，則調(diào)用EPI模式掃描得到的二級子離子全掃描圖譜，與對照品標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對，確認(rèn)是否存在非法添加，詳見圖3。由圖3可見，多個成分在保留時間上雖然不能達(dá)到完全分離，但因MRM掃描方式下單特征離子對具備專一選擇性，不會造成相互間的干擾；而EPI模式下得到的二級子離子圖具備的獨特性可以用來進(jìn)一步的比對、驗證，減少誤判的可能性。實測樣品總離子流（TIC）圖中在保留時間0.38 min處出現(xiàn)色譜峰，響應(yīng)的MRM離子對分別為294.002/249.900、294.002/213.800，離子對強(qiáng)度比為3.22%；與對照品TIC圖中雙氯芬酸鈉色譜峰的保留時間一致，響應(yīng)離子對相同且離子對強(qiáng)度比近似。進(jìn)一步將二者EPI圖譜進(jìn)行比對，結(jié)果樣品在294.2（M－1）、296.2（M+1）均有響應(yīng)，高度比符合含氯化合物質(zhì)譜規(guī)律，其二級子離子圖譜中存在250.0、227.0、189.0碎片，碎片強(qiáng)度分布與雙氯芬酸鈉對照品相似，可確認(rèn)樣品中存在非法添加雙氯芬酸鈉化學(xué)藥物成分。

圖1 17種對照品的總離子流色譜圖Fig 1 TIC chromatogram of 17 kinds of reference standard

圖2 17種對照品的增強(qiáng)離子掃描二級子離子圖Fig 2 EPI second-level daughterion diagram of 17 kinds of reference standard

表1 17種對照品質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果與方法學(xué)、檢測限結(jié)果Tab 1 Result of MS optimization，methodology and LOD for 17 substance control

圖3 實測樣品的總離子流色譜圖與增強(qiáng)離子掃描二級子離子圖Fig 3 TIC chromatogram and EPI second-level daughterion diagram of measured samples

3 討論

筆者考察了甲醇-水、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸溶液3個流動相體系。結(jié)果表明，甲醇-水（90∶10，V/V）能保證全部化合物有效洗脫，保留時間更為穩(wěn)定，且可有效減少前處理過程及柱平衡時間。

貼劑的不干膠層具有一定的黏合強(qiáng)度，如果不加處理，極易以不規(guī)則形態(tài)黏在燒杯上，直接進(jìn)行裁剪又容易黏附在剪刀、操作臺或操作員的手套上，均會影響提取效果。筆者曾使用硅藻土幫助裁剪與提取，但硅藻土存在粉體逸散。后采用將貼劑黏在濾紙上進(jìn)行裁剪提取，既方便操作又可減少交叉污染。

液質(zhì)聯(lián)用法檢測非法添加物時常采用MRM模式進(jìn)行定性或定量分析[12-13]，其掃描方式專屬性較強(qiáng)、重復(fù)性好、便于定量操作[14]。但依照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，MRM模式下進(jìn)行定性的關(guān)鍵參數(shù)為所選擇離子對強(qiáng)度比，該數(shù)值在不同條件下存在較大偏差，同時因中藥基質(zhì)復(fù)雜，假陽性現(xiàn)象時有發(fā)生，故其定性結(jié)果的準(zhǔn)確性相對不足。

我國《藥品管理法》中明確規(guī)定，藥品所含成分與國家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的成分不符，可直接判定為假藥。由此可見，對于中藥貼劑，一旦發(fā)現(xiàn)其存在藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定之外的非法添加化學(xué)藥物成分，無論其含量是否與臨床治療量匹配，都可作為違法判定的直接證據(jù)，因此在非法添加類檢驗參數(shù)中，對樣品定性的準(zhǔn)確性要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對定量精密度的要求。

針對上述問題，可采用常規(guī)MS/MS模式取得二級子離子全掃描圖來輔助定性。在該模式下，樣品分子在進(jìn)入第一重四級桿（Q1）后進(jìn)行分子離子檢測，在第二重四級桿（碰撞池）中被碰撞氣體分子打碎之后進(jìn)入第三重四級桿（Q3）檢測碎片離子，由軟件統(tǒng)一記錄數(shù)據(jù)后形成二級子離子全掃描圖，以取得足夠多的碎片離子特征數(shù)據(jù)來進(jìn)行準(zhǔn)確判定。但該模式需樣品提供足夠濃度來保證二級子離子全掃描圖的完整性，而樣品濃度過高會使得進(jìn)樣針、定量環(huán)甚至樣品注射器中存在樣品殘留，進(jìn)而可能導(dǎo)致后續(xù)樣品出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。

筆者采用MRM聯(lián)合IDA和EPI的掃描方式，在IDA-EPI模式下，當(dāng)MRM獲得的信號強(qiáng)度超過閾值后，機(jī)器開始啟動普通三重四級桿（QQQ）與線性離子阱（Trap）模式的高頻切換，在Trap模式下，Q3除具備測定碎片離子的功能外，還可同時對碎片離子進(jìn)行富集，因此能在更低的樣品濃度條件下采集更為完整的二級子離子全掃描圖。將樣品的二級子離子全掃描圖譜與對照品圖譜進(jìn)行比對后可對樣品進(jìn)行定性判斷，從而進(jìn)一步減少復(fù)雜基質(zhì)造成的影響；同時因可使用更低的樣品濃度，在樣品配制時能增加稀釋倍數(shù)以避免樣品殘留，減少樣品濃度過大而造成的假陽性現(xiàn)象。

[1] 魯藝，韓東岐，黎雪清，等.安神類和抗風(fēng)濕類中藥和保健食品中非法添加化學(xué)成分的案例分析[J].中國藥事，2015，29（8）：775-781.

[2] 倪曉霓.中成藥非法添加化學(xué)成分的現(xiàn)狀及對策[J].藥學(xué)研究，2014，33（3）：172-175.

[3] 符江，荊文光，章軍，等.中藥中非法添加問題研究現(xiàn)狀與分析[J].中草藥，2014，45（3）：437-442.

[4] 劉偉，蔡喜生，谷波，等.保健品中違法添加化學(xué)藥品分析[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2015（29）：6136-6137.

[5] 陽怡，自兆平.合理應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2015，13（15）：152-154.

[6] 蘇健.薄層色譜法檢測抗風(fēng)濕類中成藥中解熱鎮(zhèn)痛非甾體抗炎藥的非法添加[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2014，35 （5）：74-74.

[7] 池浩波，張夢虹，李國毅，等.抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中非法添加雙氯芬酸鈉快速篩查方法研究[J].中成藥，2011，33（6）：1084-1086.

[8]黃萍，凌霄.HPLC-MS/MS法測定抗風(fēng)濕中藥制劑中糖皮質(zhì)激素類化學(xué)藥[J].中國藥師，2009，12（47）：138-140. [9] 黎雪清，譚渺，蔣創(chuàng)杰，等.HPLC法快速篩查抗風(fēng)濕類中成藥和保健食品中24種非法添加化學(xué)成分[J].中成藥，2014，36（9）：1891-1894.

[10] 來國防，程賓.LC-MS法測定抗風(fēng)濕類中藥非法添加化學(xué)藥物成分[J].中國藥師，2010，13（4）：453-455.

[11] 宋寧寧，張科明，劉向紅，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定涼茶中非法添加的12種化學(xué)藥物[J].色譜，2015，33（10）：1026-1031.

[12] 陳日檬，柯春文，萬曉明，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測抗鼻炎噴劑中非法添加鹽酸萘甲唑林[J].中國藥業(yè)，2015，24（13）：33-34.

[13] 蔣麗萍，涂婕紅，徐宏祥，等.UPLC-MS/MS法測定抗疲勞類保健食品中非法添加的9中壯陽類化學(xué)藥物[J].中草藥，2015，46（15）：2238-2245.

[14] 王海東，程聰，高山，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定人血漿中氯吡格雷及其代謝物濃度[J].中國新藥與臨床雜志，2015，34（12）：955-961.

Rapid Determination of 17 Chemicals Illegally Added into Anti-rheumatic TCM Patches by UPLC-MS/MS

LI Qiang1，YUE Lei2，LI Xiaojing3（1.Henan Food and Drug Inspection Center，Zhengzhou 450018，China；2. Zhengzhou Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450015，China；3.The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

OBJECTIVE：To establish a rapid determination method for 9 kinds of glucocorticoid and 8 kinds of non-steroidal anti-inflammatory drugs illegally added into anti-rheumatic TCM patches.METHODS：UPLC-MS/MS method was adopted.The samples were separated on Acquity UPLC?BEN C18column with methanol-water（90∶10，V/V）as mobile phase at flow rate 0.4 mL/min.The column temperature was set at 30 ，and sample size was 1 μL.The ionization mode was electrospray ion source （ESI）：spray needle voltage of 5 500 V，ion source spray GS1，GS2 pressure of 50，50 psi，ion source temperature of 500 ，scanning range of m/z 50-500.The multiple reaction monitoring（MRM）combined with information-dependent acquisition（IDA）and enhanced product ion scanning（EPI）was used to rapid qualitative analysis.RESULTS：The detection limits for 17 kinds of chemical components were not more than 0.400 μg/mL.RSDs for precision，repeatability，stability tests were not more than 4.93%，7.69%，9.57%，respectively.Diclofenac sodium was detected in the sample.CONCLUSIONS：The method is selective and sensitive.It is suitable for qualitative analysis of chemicals illegally added into anti-rheumatism TCM patches.

UPLC-MS/MS；MRM；Anti-rheumatism TCM patches；Illegally added；Glucocorticoid；Non-steroidal anti-inflammatory drugs

R917

A

1001-0408（2017）12-1692-05

2016-05-07

2016-08-21）

（編輯：張 靜）

鄭州地方高校新世紀(jì)教育教學(xué)改革及人才培養(yǎng)工程立項項目（No.ZZJG-B7027）

＊主管藥師，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量控制與不良反應(yīng)。電話：0371-68683820。E-mail：fishsoft008@163.com

#通信作者：主管藥師，講師，碩士。研究方向：藥物質(zhì)量分析。E-mail：lixiaojing2050@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.30