結(jié)核分枝桿菌生物被膜體外模型的建立

侯志麗，葉 靜，梅早仙，白大鵬，吳 琦

(天津市海河醫(yī)院 天津市呼吸疾病研究所，天津300350)

結(jié)核分枝桿菌生物被膜體外模型的建立

侯志麗，葉 靜，梅早仙，白大鵬，吳 琦*

(天津市海河醫(yī)院 天津市呼吸疾病研究所，天津300350)

目的 本試驗探討如何建立結(jié)核菌生物被膜體外模型。方法 選取生長良好的非耐藥結(jié)核菌在羅氏固體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，在7H9 OADC培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)1周，使其活力相同，配置蘇通培養(yǎng)基分別在燒瓶及孔板中培養(yǎng)結(jié)核菌觀察生物膜的生長情況。結(jié)果 36株結(jié)核菌在孔板中培養(yǎng)時使用封口膜的全部培養(yǎng)出生物膜，而未使用封口膜的均培養(yǎng)失敗。燒瓶中培養(yǎng)：在培養(yǎng)3周時需要松開瓶蓋，否則生物膜生長不良。時間：培養(yǎng)2周時可看到有生物膜出現(xiàn)，5周時生物膜培養(yǎng)成熟。結(jié)論 結(jié)核菌有生物被膜，通過體外培養(yǎng)可以成功獲得。

生物被膜；結(jié)核分枝桿菌

(ChinJLabDiagn,2017,21:0686)

細菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)是細菌為了適應(yīng)自然環(huán)境，在生長過程中粘附在附著物表面或破損組織表面而形成的特殊存在形式，是由多個細菌組成的一種膜狀結(jié)構(gòu)。其化學(xué)成分主要是多糖基質(zhì)、纖維蛋白質(zhì)、脂蛋白等，它們包裹著菌細胞。生物被膜是細胞間相互協(xié)調(diào)作用的多細胞群體，是細菌的一種保護性的生長模式，具有結(jié)構(gòu)和代謝的復(fù)雜性。生物被膜中所包裹的細菌，由于被膜的屏障保護作用，能抵御外來的攻擊，并且能逃避機體自身的免疫攻擊，使細菌不被機體內(nèi)的抗體溶解和巨噬細胞吞噬，這是造成持續(xù)感染的主要原因之一，多數(shù)的人類細菌性感染與生物被膜都十分相關(guān)。形成生物被膜的黏附細菌群同時也可以釋放出生長迅速的浮游細菌，這能成為潛在的“菌巢”，為細菌的生長提供了另一個有利的環(huán)境。

生物膜是細菌為了適應(yīng)自然環(huán)境而采取的生存戰(zhàn)略,但正是細菌生物被膜的這些特性，從而導(dǎo)致了嚴(yán)重的臨床問題[1,2]。對生物被膜的研究，可以用來在診斷感染性疾病，針對性治療感染性疾病方面起很大的作用。近些年,美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)也為此投入大量研究資金[3,4]。

1 資料與方法

本實驗，選取生長良好的非耐藥結(jié)核菌36株在羅氏固體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，在7H9 OADC培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)1周，使其活力相同，配置蘇通培養(yǎng)基分別在燒瓶及孔板中培養(yǎng)結(jié)核菌觀察生物膜的生長情況。36株菌每一株均需準(zhǔn)備4份進行培養(yǎng)，1、2組在孔板中培養(yǎng)，第1組孔板縫隙處用封口膜包裹，第2組不使用封口膜；3、4組在燒瓶中培養(yǎng)，第3組瓶蓋始終都塞緊，第4組在培養(yǎng)第3周末松開瓶蓋。觀察不同時間點，不同條件對生物被膜形成的影響。

1.1 結(jié)核菌復(fù)蘇

挑選36株生長良好的非耐藥結(jié)核菌在羅氏培養(yǎng)基中復(fù)蘇一遍。

1.2 結(jié)核菌二次培養(yǎng)

在復(fù)蘇好的羅氏培養(yǎng)基中加入7H9 OADC培養(yǎng)液，放在搖床中培養(yǎng)1周。

1.3 接種前處理

將待處理菌株從培養(yǎng)箱中取出,經(jīng)過兩次離心后，加入蘇通培養(yǎng)基，混勻，取1 ml,用分光光度計(600 nm)測OD 值。

1.4 接種

1.4.1 孔板中接種 把第1組及第2組的菌各提取3份，測好OD值；準(zhǔn)備10個孔板(第1組5個，第2組5個)，取0.1OD值的結(jié)核菌加入孔中，通過稀釋加入，每個孔板100 μl；在每一個含有結(jié)核菌的孔中加入蘇通培養(yǎng)基約100 μl；第1組孔板縫隙處用封口膜包裹，第2組不使用封口膜；所有孔板放入溫箱中，對比其發(fā)展過程。1.4.2 燒瓶中接種 把第3組及第4組的菌各提取1份，測好OD值；準(zhǔn)備72個燒瓶，每個瓶中放入25 ml蘇通培養(yǎng)基，再加入250 μl結(jié)核菌；擰緊每一個瓶蓋；第3組瓶蓋始終都塞緊，第4組在培養(yǎng)第3周末松開瓶蓋；所有培養(yǎng)瓶放入溫箱中，對比其發(fā)展過程。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核菌生物被膜體外培養(yǎng)條件

結(jié)核分枝桿菌生物被膜的成長，在培養(yǎng)第2周末可見生物被膜生長的痕跡，第5周末被膜生長成熟 (見圖1)。

圖1 結(jié)核分枝桿菌生物被膜5周的生長過程

2.2 使用封口膜覆蓋孔板培養(yǎng)五周后，可見生物被膜的出現(xiàn)，而且生長良好(見圖2)。2.3 未使用封口膜的孔板中，生物被膜的培養(yǎng)失敗,所有孔板中未見結(jié)核分枝桿菌被膜形成(見圖3)。

2.4 第3組生物膜生長良好，第4組生物膜長勢較第3組弱，從所培養(yǎng)的孔板中可見在培養(yǎng)過程中，不斷緊松瓶蓋的孔板組生物被膜生長較持續(xù)關(guān)閉狀態(tài)的孔板生長良好(見圖4、5)。

圖2 5周后生物被膜生長情況 圖3 未使用封口膜的孔板中生物被膜生長情況 圖4 第3組塞緊/松開瓶蓋

2.5 培養(yǎng)過程中經(jīng)常被晃動或查看的孔板及培養(yǎng)瓶中生物膜的生長要弱于其它培養(yǎng)皿中的生物膜。瓶中生物膜的生長要弱于其它培養(yǎng)皿中的生物膜。

3 討論

細菌生物被膜是細菌吸附于生物材料或機體腔道表面，細菌分泌出多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等，并將細菌自身包裹其中形成的膜樣物，是由多個細菌組成的一種膜狀結(jié)構(gòu)，是細菌為適應(yīng)自然環(huán)境、有利于生存而特有的存在形式，具有結(jié)構(gòu)和代謝的復(fù)雜性。生物被膜這種結(jié)構(gòu)，能很好的幫助細菌抵制各種不良環(huán)境而使其更好的生存、生長和繁殖。結(jié)核菌在適合的條件下亦可形成生物膜，且因此出現(xiàn)抗藥性。生物被膜一旦形成，對抗菌藥物及機體免疫力有著天然的抵抗力，用抗菌藥物就難以清除徹而且只能殺死生物被膜表面或血中導(dǎo)致感染發(fā)作的游離細菌。當(dāng)機體抵抗力下降時，生物被膜中底，存活的細菌就又可以釋放出來，重新引起感染。

圖5 第4組擰緊瓶蓋

目前對于金葡菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等生物膜的研究較深入。金葡菌生物膜培養(yǎng)時，需要振動培養(yǎng)，并且振動條件下進行培養(yǎng)的生物被膜的表面積顯著高于靜止培養(yǎng)的生物被膜的表面積。這個現(xiàn)象的主要原因是，靜止培養(yǎng)的細菌附著后仍進行生長,分裂和繁殖,其它游離細菌繼續(xù)附著,最終導(dǎo)致該附著位點的細菌生長環(huán)境比振動培養(yǎng)情況下還要擁擠,有毒的代謝物堆積,許多細菌得到的營養(yǎng)物質(zhì)相對減少[5]。振動使細菌周圍的毒素分散,更多營養(yǎng)物質(zhì)提供附著點周圍,從而為BF形成創(chuàng)造更有利的條件,使其表面積增大。而在低營養(yǎng)條件下,細菌嵌入在其自身分泌的細胞外基質(zhì)中,使胞外基質(zhì)合成分泌增加,導(dǎo)致BF形成弱,表面積小[6]。

然而結(jié)核菌BF在培養(yǎng)過程中經(jīng)常被晃動或查看的孔板及培養(yǎng)瓶中生物膜的生長要弱于其它培養(yǎng)皿中的生物膜，這與金葡菌的生長條件明顯不同，考慮與結(jié)核菌緩慢的生長方式有關(guān)。結(jié)核菌生長緩慢，不需要在短時間內(nèi)獲得大量的營養(yǎng)物質(zhì)也能存活。

在燒瓶中培養(yǎng)結(jié)核菌BF時，需要在三周時松開瓶蓋，這樣可以提供更多的氧氣，從而保證生物膜進一步的生長。這與結(jié)核菌好發(fā)于通氣良好的肺尖組織是一致的。我們在氣管結(jié)核患者的氣道內(nèi)，經(jīng)?？梢钥吹酱罅堪咨哪游镔|(zhì)，需要反復(fù)的清除及局部注藥方可能治愈，推測與生物膜的形成有相關(guān)性。

在孔板中培養(yǎng)生物膜時，使用封口膜是成功建立結(jié)核菌生物膜體外模型的關(guān)鍵，使用封口膜成功是因為其保證了結(jié)核菌生物膜生長環(huán)境的濕度以及減少了培養(yǎng)基的揮發(fā)，為生物膜的生長提供了良好的環(huán)境。

當(dāng)前，在耐藥結(jié)核愈演愈烈的狀況下，加之近年來人類免疫缺陷病毒(HIV)與結(jié)核病雙重感染率急劇上升，器官移植、免疫抑制劑應(yīng)用及高齡患者感染結(jié)核的增多，尋找結(jié)核菌耐藥機制，克服多重耐藥菌是治療肺結(jié)核成敗的關(guān)鍵問題。細菌生物被膜廣泛存在于自然界中，只要條件允許，任何細菌都可形成生物被膜，近來美國匹茲堡大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌有非凡的抗藥性，這種特性促使抗結(jié)核化療的療程長達6-9個月，但是這種抗藥性的機制尚不明確。許多微生物為了抵抗環(huán)境的壓力形成了生物膜，而結(jié)核菌亦存在生物膜。有生物膜的結(jié)核桿菌及恥垢分支桿菌，可承受超過50倍的最小抑菌濃度的抗結(jié)核藥異煙肼和利福平。說明生物膜在結(jié)核菌的抗藥性中發(fā)揮了重要的作用[7,8]。

由于生物被膜的特殊結(jié)構(gòu)及特性，使得生物被膜內(nèi)的細菌可對抗多數(shù)抗生素的殺菌作用，要阻止細菌生物被膜引起的感染，最有效的方法是阻止細菌生物被膜的形成，在生物被膜形成的前期就進行干預(yù)，就能起到事半功倍的作用。因此，如何清除細菌生物被膜成為近年來的研究熱點。

[1]Costerton JW.Introduction to biofilm[J].Int J Antimicrob Agents,1999,11:217.

[2]Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP.Bacterial biofilms:a common cause of persistent in fections[J].Science,1999,284(5418):1318.

[3]Arweiler-Harbeck D,Sanders A,HeldM,et al.Does metal coating improve the durability of silicone voice prostheses[J]?Acta olaryngol,2001,121(5):643.

[4]Bjarnsholt T,Jensen P,Burmlle M,et al.Pseudomonas aeruginosa tolerance to tobramycin,hydrogen peroxide and polymorphonuclear leukocytes is quorum-sensing dependent[J].Microbiology,2005,151(Pt 2):373.

[5]Lin Xing,Huang Yunchao.Influence of on bacterial adherence and formation of bacterial biofilm to blomaterials[J].Biomedical Engineering Foreign Medical Sciences,2005,(5):290.

[6]Tsai YP,Pai TY,Qiu JM.The impacts of the AOC concentration on biofilm formation under higher shear force condition[J].J Biotechnol，2004，111(2):155.

[7]Ojha,A,Anand M,Bhatt A,et al.GroEL1:a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria[J].Cell,2005,123(5),861.

[8]Ojha AK,Trivelli X,Guerardel Y,et al.Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms[J].J Biol Chem,2010,285(23):17380.

Mycobacterium tuberculosis biofilm in vitro model

HOUZhi-li,YEJing,MEIZao-xian,etal.

(TianJinHaiHeHospital,TianJinInstituteofRespiratoryDiseases,Tianjin300350，China)

Objective This study to explore how to establish model of tuberculosis bacterium biofilm in vitro.Methods Select the non-drug-resistant TB bacteria and resuscitate them in Roche solid culture medium.Then culture then for one week in the 7H9 OADC medium in order to reach the same activity.Culture the TB bacteria in screw capped bottle and orifice plate with Sauton's media.Results In orifice plate,we successfully obtained biolfilm for all bacterial when used sealing film.In screw capped bottle,we need to tight the cap until the end of the third week and loose the cap at the end of the third week.We can observed the biofilm at the end of the second week and found the structure matured by the end of the fifth week.Conclusion TB biofilm can be successfully cultured in vitro.

Bacterial biofilm；Mycobacterium tuberculosis

天津市衛(wèi)生局資助課題(2010KR08)

1007-4287(2017)04-0686-03

R378.91+1

A

2016-04-20)

*通訊作者