HSP70基因多態(tài)性與冠心病合并抑郁的關(guān)聯(lián)分析

彭敏+禹順英+邱小燕+汪惠芝+賴平妹+鮑廣林

【摘要】 目的：探討HSP70基因rs2075799基因多態(tài)性與冠心病共病抑郁的關(guān)聯(lián)。方法：收集107例冠心病患者臨床資料，采用漢密爾頓抑郁量表（HAMD-17）對(duì)患者進(jìn)行篩查，收集到32例冠心病共病抑郁患者和75例冠心病未共病抑郁的患者，抽取外周靜脈血，提取DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）方法，對(duì)HSP70基因rs2075799的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：冠心病共病抑郁組患者HSP70基因rs2075799位點(diǎn)基因型分布頻率和等位基因頻率與冠心病未共病抑郁組患者比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29）。結(jié)論：未發(fā)現(xiàn)HSP70基因rs2075799多態(tài)性與冠心病患者共病抑郁的易感性之間的關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】 HSP70； 冠心?。?抑郁； 共病； 多態(tài)性

Correlation Analysis of HSP70 Gene Polymorphism and Depressive Disorder in Patients with Coronary Artery Disease/PENG Min，YU Shun-ying，QIU Xiao-yan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（09）：029-032

【Abstract】 Objective：To investigate whether polymorphisms of HSP70 exerts any influence on depressive disorder in coronary artery disease（CAD）.Method：Collect The clinical data of 107 patients with coronary heart disease，used Hamilton Depression Scale （HAMD-17） screening for patients with HAMD-17 were collected，32 CAD patients with depressive disorder and 75 CAD patients without depressive disorder，venous blood was extracted from peripheral DNA，used restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction （PCR-RFLP） method for detection of single nucleotide polymorphism of HSP70 gene of rs2075799.Result：Comparison of coronary heart disease comorbidity in patients with HSP70 depression gene rs2075799 genotype distribution and allele frequencies in patients with coronary artery disease without comorbid depression patients，the differences were no statistically significant（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29）.Conclusion：No significant association was found between rs2075799 single nucleotide polymorphisms and the comorbidity of CAD with depression.

【Key words】 HSP70； Coronary artery disease； Depression； Comorbidity； Polymorphism

First-authors address： The Peoples Hospital in Nanshan District of Shenzhen，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.09.009

冠心病與抑郁癥共病率非常高，研究報(bào)道，冠心病患者中18%～45%的人患有抑郁癥，而抑郁癥又會(huì)增加冠心病的急性冠脈事件發(fā)生率及死亡率，因此深入了解兩者共病的病理生理機(jī)制，對(duì)于兩者共病的預(yù)防和精準(zhǔn)治療具有重要的意義[1-3]。但兩者之間高共病率的原因遠(yuǎn)未闡明，之前的觀點(diǎn)包括抑郁癥引發(fā)冠心病和冠心病引發(fā)抑郁癥。后來(lái)的觀點(diǎn)認(rèn)為：兩者之間可能有著共同的病因或者病理生理發(fā)病機(jī)制[4]。Mccaffery等[5]的研究發(fā)現(xiàn)：冠心病和抑郁癥可能有共同的遺傳易損性，其研究發(fā)現(xiàn)大約20%的抑郁癥和冠心病的共同變化可以歸因于共同的遺傳因素。目前已經(jīng)較為明確的共同的遺傳易感基因是與應(yīng)激和炎癥相關(guān)的基因，例如糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性、5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的啟動(dòng)子序列（5-HTT LPR）多態(tài)性、BDNF基因多態(tài)性[6-7]。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）基因是一個(gè)與應(yīng)激相關(guān)的重要的編碼基因，位于6號(hào)染色體短臂MHC-Ⅲ區(qū)，其所編碼的蛋白質(zhì)又稱為應(yīng)激蛋白或者熱休克蛋白，熱休克蛋白是細(xì)胞存活通路上重要的一員。在遭遇高溫、缺氧、自由基、感染及心理應(yīng)激等多種應(yīng)激源的時(shí)候，正常狀態(tài)下以無(wú)活性的單體形式存在于胞漿中的HSF1被激活，轉(zhuǎn)變成三聚體，移位至胞核，結(jié)合至HSP基因5端啟動(dòng)子區(qū)的熱休克元件（heat shock element，HSE）上而啟動(dòng)HSP基因的誘導(dǎo)表達(dá)。HSP70是其中被認(rèn)為功能最重要的，其最重要的功能在于幫助細(xì)胞適應(yīng)各種可預(yù)測(cè)和不可預(yù)測(cè)的系列應(yīng)激反應(yīng)，例如在不同應(yīng)激源下，包括心理應(yīng)激，可以誘導(dǎo)HSP70在心肌和腦組織大量表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞以及神經(jīng)元可塑性發(fā)揮的保護(hù)作用[8-9]。其機(jī)制涉及到修復(fù)受損的蛋白質(zhì)，幫助受損的蛋白質(zhì)正確折疊，增加Bcl-2表達(dá)，穩(wěn)定和保護(hù)線粒體功能，對(duì)抗谷氨酸興奮性毒性，調(diào)節(jié)鈣離子和鈣調(diào)蛋白，阻斷Caspase 3活化，從而抑制級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，抑制凋亡，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)等。

盡管HSP70基因是在進(jìn)化上高度保守的基因，但是研究發(fā)現(xiàn)其基因也有突變，這就意味著HSP70突變可能在機(jī)體遭遇反復(fù)應(yīng)激下，影響和改變機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，使機(jī)體對(duì)應(yīng)激的耐受性減弱和對(duì)疾病的易感性增加，形成基因與環(huán)境的交互作用，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。目前已經(jīng)有很多研究發(fā)現(xiàn)HSP70基因多態(tài)性與多種心身疾病和精神疾病的疾病易感性有關(guān)，包括糖尿病、腦卒中、原發(fā)性高血壓、冠心病、抑郁癥、雙向情感障礙、精神分裂癥[10-16]。冠心病和抑郁癥是兩個(gè)均與應(yīng)激密切相關(guān)的疾病。上述這些研究提示：HSP70基因多態(tài)性既與冠心病易感性，又與抑郁癥易感性有關(guān)。然而，HSP70基因突變是否改變通過(guò)改變機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)參與冠心病和抑郁癥的發(fā)生發(fā)展，成為冠心病共病抑郁的共同易感因素，參與其共同的病理生理機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬選取HSP70基因上rs2075799位點(diǎn)，檢測(cè)冠心病患者外周血HSP70基因上rs2075799基因型多態(tài)性，探索其與冠心病共病抑郁之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年7月-2016年10月本院住院冠心病患者為研究對(duì)象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：冠心病定義為冠脈造影時(shí)左主干、前降支、回旋支、右冠脈或其主要分支的血管直徑狹窄≥50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重肝、腎功能不全或其他臟器嚴(yán)重功能不全者；（2）合并腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病者；合并腦血管意外及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；（3）合并急、慢性感染性疾病、高熱等者；（4）有嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙及檢查不合作者；（5）既往有其他精神疾病個(gè)人史或家族史者。采用《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-5）診斷標(biāo)準(zhǔn)入組冠心病合并抑郁患者，采用漢密爾頓抑郁量表（Hamilton depression scale，HAMD-17）評(píng)定抑郁嚴(yán)重程度，總分≥24分為嚴(yán)重抑郁；17分≤總分<24分為中度抑郁；7分≤總分<17分為輕度抑郁；總分≤7分為無(wú)抑郁癥狀?？偡帧?7分患者為冠心病合并抑郁組，總分≤7分為冠心病組未合并抑郁組。經(jīng)篩選后，共入組107例，男71例，女36例，其中冠心病共病抑郁組（共病組）32例，冠心病未共病抑郁組（非共病組）75例。兩組患者的年齡、吸煙史、飲酒史、空腹血糖、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。本研究樣本收集及研究方案已通過(guò)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳六院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，所有患者知情同意，并簽署知情同意書(shū)后方納入試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 采血 清晨空腹采集靜脈血5 mL，用于DNA提取，DNA提取和基因多態(tài)性檢測(cè)均在上海市精神衛(wèi)生中心，遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.2 DNA提取 使用萊楓1 mL血液基因組DNA提取試劑盒（萊楓生物科技有限公司）的常規(guī)方法提取血液基因組DNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermofisher）測(cè)定DNA的濃度及光密度（optical density，OD）OD值。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 引物由Invitrogen公司合成，序列如下：rs2075799-F：AGAGTTGTGTGCAGACCTGT，rs2075799-R：CTGGGTGCTGGAGGGATTC。反應(yīng)體系為15 μL，其中DNA（原液）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mM）0.3 μL，10*PCR Buffer（Takara）1.5 μL，Taq HS（Takara）（5 U/μL）0.1 μL，引物（0.4 μL+0.4 μL）（10 μmoL），以滅菌水補(bǔ)足到15 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)；72 ℃

8 min。電泳后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）分析擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法測(cè)定HSP70基因rs2075799基因型多態(tài)性 10 μL PCR產(chǎn)物與10 U PvuⅡ（NEB）（10 U/μL）酶切過(guò)夜后，將PCR產(chǎn)物于凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行觀察拍照和結(jié)果分析，與分子量標(biāo)準(zhǔn)物比較各片段的大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用擬合優(yōu)度卡方計(jì)算各組各位點(diǎn)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型的判定和測(cè)序驗(yàn)證 PCR產(chǎn)物以及酶切產(chǎn)物見(jiàn)圖1、2。

2.2 兩組Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗(yàn) 共病組與非共病組rs2075799位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg的平衡法則，吻合度檢驗(yàn)良好（P>0.05）。

2.3 兩組基因型及等位基因頻率分布的比較 共病組中突變基因型AA和等位基因A的頻率均高于未共病組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29），見(jiàn)表2、3。

3 討論

研究報(bào)道，冠心病和抑郁癥在全球疾病負(fù)擔(dān)分別排行第一和第三，Roth等[17]和Hughes等[18]的研究均認(rèn)為，到2025年或2060年，冠心病和抑郁癥依然位列全球疾病負(fù)擔(dān)的3個(gè)主要病因。兩者共病更加重冠心病和抑郁的病情，預(yù)后更加惡化，更加加重疾病負(fù)擔(dān)[19]。尤其在中國(guó)，隨著我國(guó)人口老齡化情況的日益嚴(yán)重，冠心病和抑郁癥發(fā)病率將日益增加，疾病負(fù)擔(dān)也將更加繁重。深入探究了解冠心病共病抑郁癥的生物學(xué)因素，尋找其共同的致病易感因素，以及基因環(huán)境交互作用，有利于早期預(yù)防以及指導(dǎo)治療，達(dá)到精準(zhǔn)醫(yī)療的目的。

既往已經(jīng)有大量的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70基因與冠心病的易感性有關(guān)，例如：HSP70的+190G/C的CC型攜帶者冠心病風(fēng)險(xiǎn)高于GG型攜帶者[13，20-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，血清HSP70高，冠心病風(fēng)險(xiǎn)低[23]。而且另外的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70基因突變可能通過(guò)影響HSP70的表達(dá)，與一些精神疾病的易感性有關(guān)，如筆者之前的研究也發(fā)現(xiàn)，HSP70在慢性應(yīng)激中對(duì)小鼠焦慮樣行為具有保護(hù)作用[9，24]。Pae等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70基因上rs2075799位點(diǎn)G等位基因與抗抑郁治療反應(yīng)差有關(guān)，提示HSP70基因rs2075799多態(tài)性可能參與抑郁的病理生理或抗抑郁藥生理機(jī)制有關(guān)。但是HSP70基因rs2075799基因型多態(tài)性是否與冠心病共病抑郁有關(guān)尚不清楚。

本研究HSP70基因rs2075799基因多態(tài)性與冠心病伴抑郁情緒障礙之間關(guān)系，結(jié)果顯示：HSP70基因rs2075799基因突變型A等位基因頻率在冠心病共病抑郁的患者和冠心病未共病抑郁的患者中分別是25.0%和18.7%，顯示突變等位基因在冠心病共病抑郁的患者中增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=1.10，P=0.16； 字2=2.24，P=0.29）。因此本研究不能證實(shí)HSP70基因rs2075799的A等位基因型與冠心病患者共病抑郁的遺傳易感有關(guān)。分析結(jié)果，一方面本研究的樣本量尚小，只是對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了初步的探討，在后續(xù)的驗(yàn)證研究中需要擴(kuò)大樣本量對(duì)這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。另一方面，抑郁癥等疾病往往多個(gè)基因參與了其致病過(guò)程，一個(gè)基因位點(diǎn)的突變貢獻(xiàn)部分的作用，因此下一步需要對(duì)HSP70其他的基因位點(diǎn)和多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析，并對(duì)基因位點(diǎn)所編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行分析，深入探索其機(jī)制。另外通過(guò)患者進(jìn)行跟蹤隨訪，對(duì)其治療效果與基因型的關(guān)系進(jìn)行分析，可以更加進(jìn)一步深入探索HSP70基因與冠心病共病抑郁及其治療和預(yù)后之間的關(guān)系及其機(jī)制。

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