16種轉(zhuǎn)基因大豆品系的實(shí)時(shí)熒光PCR法篩查

錢云開，高 飛，王海洋，崔宗巖，吳 曦，肖艷霞

(秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 秦皇島 066004)

檢測(cè)分析

16種轉(zhuǎn)基因大豆品系的實(shí)時(shí)熒光PCR法篩查

錢云開，高 飛，王海洋，崔宗巖，吳 曦，肖艷霞

(秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 秦皇島 066004)

采用實(shí)時(shí)熒光PCR法，對(duì)河北主要進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆口岸秦皇島港及京唐港的45批次轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了16種轉(zhuǎn)基因大豆品系篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在45批樣品中均檢測(cè)到GTS-40-3-2品系；30批樣品檢測(cè)到MON89788品系，占所檢測(cè)樣品66.7%；14批樣品檢測(cè)到A2704-12品系，占所檢測(cè)樣品31.1%；2批樣品檢測(cè)到MON87701品系，占所檢測(cè)樣品4.4%；1批樣品檢測(cè)到MON87701×MON89788品系，占所檢測(cè)樣品2.2%；其他品系在所有45批樣品中均未檢測(cè)到。通過(guò)對(duì)河北主要進(jìn)口口岸轉(zhuǎn)基因大豆品系方面摸底篩查，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆品系進(jìn)口管控提供了數(shù)據(jù)支持。

轉(zhuǎn)基因大豆；實(shí)時(shí)熒光PCR；進(jìn)口；品系

大豆是我國(guó)大宗進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品，自1997年我國(guó)開始轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口以來(lái)，歷年進(jìn)口量呈現(xiàn)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[1]。海關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2012—2015年我國(guó)進(jìn)口大豆分別為5 838、6 338、7 140萬(wàn)t和8 100 萬(wàn)t。進(jìn)口的大豆幾乎全部為轉(zhuǎn)基因大豆，大量的進(jìn)口大豆對(duì)我國(guó)的非轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)造成巨大沖擊[2]。全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積最大的國(guó)家為美國(guó)、巴西和阿根廷，這三國(guó)在2013年的轉(zhuǎn)基因大豆種植面積占世界轉(zhuǎn)基因大豆種植面積的91.5%[3]，相應(yīng)的我國(guó)大豆進(jìn)口來(lái)源國(guó)比較集中，也主要為美國(guó)、巴西和阿根廷[4]。

同時(shí)，近年來(lái)轉(zhuǎn)基因食品社會(huì)關(guān)注度高[5]，食品安全和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)污染不確定，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品密切關(guān)注，加強(qiáng)篩選普查[6]。目前，由美國(guó)和歐盟公布的信息來(lái)看，世界范圍內(nèi)已批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因大豆品系已超過(guò)16種，而截至2016年2月，我國(guó)僅批準(zhǔn)進(jìn)口大豆品系9種。

現(xiàn)在，我國(guó)各出入境檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)主要依據(jù)SN/T 1195—2003《大豆中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)方法》，以及GB/T 19495.5—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定量PCR檢測(cè)方法》。由于標(biāo)準(zhǔn)制定較早，這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中只涉及了大豆品系“GTS-40-3-2”的檢測(cè)方法。最近幾年農(nóng)業(yè)部、國(guó)家質(zhì)檢總局公布了幾個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，但由于受儀器條件及檢測(cè)方法所限還沒有獲得普遍的推廣。目前歐美國(guó)家主要采用實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行檢測(cè)。

進(jìn)口口岸檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)入國(guó)內(nèi)的第一道關(guān)，口岸的檢測(cè)數(shù)據(jù)分析是掌握轉(zhuǎn)基因大豆信息的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。河北主要港口秦皇島港和京唐港長(zhǎng)期進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆。我實(shí)驗(yàn)室收集了2012年9月至2014年7月間40船次45批轉(zhuǎn)基因大豆樣品及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，整理了成套的轉(zhuǎn)基因大豆品系實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法開展篩查檢測(cè)。檢測(cè)的結(jié)果為監(jiān)管部門提供參考，也為制定適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)政策措施提供技術(shù)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)樣品

實(shí)驗(yàn)室收集了可應(yīng)用于大豆轉(zhuǎn)基因品系檢測(cè)的13種轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及對(duì)于雜交品系采用的單品系混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具體見表1。轉(zhuǎn)基因大豆品系標(biāo)準(zhǔn)分別購(gòu)自歐盟聯(lián)合研究中心、美國(guó)油脂化學(xué)協(xié)會(huì)(AOCS) 以及農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中心。

在此次實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)室共收集了2012年9月至2014年7月期間40船次共45批轉(zhuǎn)基因大豆樣品。其中美國(guó)樣品25批，阿根廷樣品9批，巴西樣品7批，烏拉圭樣品3批，加拿大樣品1批。

1.1.2 試劑與儀器

CTAB、EDTA、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙酸鈉、乙醇、Tris飽和酚，Solarbio公司；CTAB提取液：55 mmol/L CTAB，1 400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，用10% 鹽酸調(diào)pH至8.0，121℃高壓滅菌20 min，備用；CTAB沉淀液：13.75 mmol/L CTAB，40 mmol/L NaCl，121℃高壓滅菌20 min，備用；TE 緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)；Tris飽和酚抽提液：Tris飽和酚-三氯甲烷-異戊醇(體積比25∶24∶1)。引物探針序列見表2。

PCR System7900基因擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI；研磨機(jī) MM301，德國(guó) Retsch；PCR試劑盒，美國(guó)ABI。

表1 大豆品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抽樣與制樣

依據(jù)SN/T 1194—2003《植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)抽樣和制樣方法》將所收集的45批次樣品通過(guò)分點(diǎn)采樣然后縮分為5 kg小樣得到。將大豆樣品在研磨機(jī)中均勻粉碎，稱取粉狀樣品。

1.2.2 樣品DNA的提取

稱取100 mg的轉(zhuǎn)基因大豆粉末于2 mL的離心管中，加入500 μL CTAB提取液混勻，65℃水浴加熱60 min。加入500 μL Tris飽和酚抽提液，混勻，離心取上清加到1.5 mL離心管中，加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫孵育60 min。12 000g離心5 min 棄上清，先加入1.2 mol/L氯化鈉水溶液350 μL搖勻溶解沉淀，再加入350 μL氯仿?lián)u勻。離心取上清至1.5 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇搖勻靜置30 min。離心棄上清，加入1 000 μL的70%乙醇洗滌2次，離心靜置晾干，溶于100 μL滅菌去離子水中。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括12.5 μL 2×real time PCR Buffer，正向引物、反向引物各1 μL(終濃度為0.2 μmol/L)，探針1 μL (終濃度為0.2 μmol/L)，提取的樣品DNA 模板2 μL，純水10 μL[7]。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，2 min；95℃，10 min； 95℃，15 s，60℃，1 min循環(huán)40 次。

1.2.4 雜交品系的檢測(cè)

雜交品系的檢測(cè)為對(duì)父本和母本單品系的引物探針分別檢測(cè)，共同的陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)檢。選取樣品袋中5個(gè)不同部位的單粒大豆，每個(gè)部位2個(gè)平行，研磨成粉末制樣，其中仍然為陽(yáng)性者即為含有雜交品系。

表2 引物探針序列

2 結(jié)果與討論

2.1 品系篩查結(jié)果

實(shí)驗(yàn)對(duì)45批樣品按表1進(jìn)行16種轉(zhuǎn)基因大豆品系檢測(cè)分析，結(jié)果見表3。由表3可知，45批樣品中均檢測(cè)到GTS-40-3-2品系；30批樣品檢測(cè)到MON89788品系，占所檢測(cè)樣品66.7%；14批樣品檢測(cè)到A2704-12品系，占所檢測(cè)樣品31.1%；2批樣品檢測(cè)到MON87701品系，占所檢測(cè)樣品4.4%；1批樣品檢測(cè)到MON87701×MON89788品系，占所檢測(cè)樣品2.2%；其他品系在45批樣品中均未檢測(cè)到。

表3 45批樣品的轉(zhuǎn)基因大豆品系檢測(cè)結(jié)果

2.2 主要的進(jìn)口國(guó)家篩查結(jié)果

對(duì)美國(guó)、阿根廷、巴西、烏拉圭、加拿大的品系分布和篩查結(jié)果見表4。由表4可知，美國(guó)作為主要的轉(zhuǎn)基因大豆出口國(guó)，在轉(zhuǎn)基因品系上除了GTS-40-3-2以外，MON89788也是其主要的轉(zhuǎn)基因大豆品系，檢出率高達(dá)96.0%。阿根廷、巴西的轉(zhuǎn)基因品系也在不斷增加中，分別檢測(cè)到了5種和4種。

2.3 討論

近年來(lái)我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的科研開發(fā)和引進(jìn)都持開放態(tài)度，我國(guó)目前轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化趨勢(shì)也在不斷地推進(jìn)過(guò)程中，國(guó)外對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口的轉(zhuǎn)基因品系種類也會(huì)不斷增加。 因此，目前對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)需求已經(jīng)不單單停留在篩查CaMV 35S、NOS、CP4 EPSPS等外源基因上，轉(zhuǎn)基因大豆品系檢測(cè)能夠提供明確的大豆品系，獲得可追溯的數(shù)據(jù)，也能夠反映出更多的轉(zhuǎn)基因作物的種植和貿(mào)易信息，將是新形勢(shì)下轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的發(fā)展方向。

從本次轉(zhuǎn)基因品系篩查的結(jié)果看，沒有檢測(cè)到未經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆品系，說(shuō)明河北主要進(jìn)口口岸進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆均符合我國(guó)進(jìn)口大豆轉(zhuǎn)基因安全方面的要求，現(xiàn)階段總體進(jìn)口風(fēng)險(xiǎn)較低。但從主要進(jìn)口國(guó)品系的分布情況來(lái)看，進(jìn)口國(guó)的轉(zhuǎn)基因大豆的品系越來(lái)越多樣化，隨著主要進(jìn)口國(guó)轉(zhuǎn)基因品系種植品種的增加，進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆品種也逐漸多元化。例如美國(guó)大豆由最初只種植GTS-40-3-2品系大豆，到目前為止GTS-40-3-2、MON89788幾乎全部檢出。此次在巴西和阿根廷大豆中也檢測(cè)到了我國(guó)2013年6月新批準(zhǔn)的MON87701、MON87701×MON89788品系大豆，并且巴西和阿根廷的轉(zhuǎn)基因品系也分別增加到了4種和5種。這些都說(shuō)明進(jìn)口國(guó)的種植品系在不斷地豐富，新的耐除草劑、抗蟲大豆品種以及雜交品種將持續(xù)地增加，進(jìn)口到非法轉(zhuǎn)基因品系的潛在風(fēng)險(xiǎn)在增加。我國(guó)是最早培育和種植大豆的國(guó)家，種質(zhì)資源豐富，品質(zhì)優(yōu)良[8]，但由于生產(chǎn)成本較高，近年來(lái)不斷地受到國(guó)外轉(zhuǎn)基因的沖擊[9]。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因大豆品系的不斷增加也使得發(fā)生基因漂移等對(duì)環(huán)境和種質(zhì)資源影響的風(fēng)險(xiǎn)增大[10]。

另外，轉(zhuǎn)基因大豆品系檢測(cè)仍然存在一些不足[7]，尤其在取樣、制樣環(huán)節(jié)，樣品的代表性依然是限制檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的環(huán)節(jié)。目前進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)按進(jìn)口大豆操作規(guī)程取樣，但是船艙的容量大、貨物多，如何提高全船混合樣品的代表性，尤其是雜交品系的代表性將是提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性的重要途徑。

3 結(jié) 論

實(shí)時(shí)熒光PCR法具有快速準(zhǔn)確、靈敏度高、污染低等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為主要的轉(zhuǎn)基因品系檢測(cè)方法。本文收集整理并建立的16種轉(zhuǎn)基因大豆品系的實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)方法，可對(duì)目前國(guó)際上主要的轉(zhuǎn)基因大豆品系進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，有效補(bǔ)充了國(guó)內(nèi)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因大豆品系的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)的不足，為轉(zhuǎn)基因大豆的品系研究提供了參考。

從對(duì)河北主要進(jìn)口口岸轉(zhuǎn)基因大豆品系篩查結(jié)果來(lái)看，轉(zhuǎn)基因品系呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆污染方面的篩查仍然需要持續(xù)的保持關(guān)注。

[1] 張婷婷．中國(guó)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口規(guī)制研究[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2015(4)：14-16.

[2] 徐娜，付東，郝潔，等.我國(guó)大豆進(jìn)口對(duì)大豆產(chǎn)業(yè)安全帶來(lái)的影響及對(duì)策分析[J]. 食品研究與開發(fā)，2014(18): 327-329.

[3] 崔寧波，宋秀娟.國(guó)外轉(zhuǎn)基因大豆種植與育種研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015(8):103-108.

[4] 周靜，谷強(qiáng)平，杜吉到.中國(guó)大豆進(jìn)口依賴性及其對(duì)大豆進(jìn)口安全的影響[J].大豆科學(xué)，2015(6):503-506.

[5] 徐麗麗，田志宏.歐盟轉(zhuǎn)基因作物審批制度及其對(duì)我國(guó)的啟示[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014(3)：1-10.

[6] 梁靚，李毅然.轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的應(yīng)用價(jià)值和安全風(fēng)險(xiǎn)展望[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2015(11)：4373-4377.

[7] 華麗，陳萍，鮑洪恩，等.進(jìn)境大豆存在問(wèn)題及檢驗(yàn)檢疫監(jiān)管對(duì)策[J].大豆科技，2014(4)：42-44.

[8] 王樂，趙曉婷.黑龍江省2014 年大豆轉(zhuǎn)基因情況普查與分析報(bào)告[J].中國(guó)油脂，2015,40(10)：1-5.

[9] 蔣新正.對(duì)中國(guó)大豆綜合產(chǎn)業(yè)情況的分析及建議[J].中國(guó)油脂，2007,32(3)：11-15.

[10] 皇甫超河，楊殿林，王志勇，等.轉(zhuǎn)基因大豆在中國(guó)發(fā)生基因漂移的風(fēng)險(xiǎn)性[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008(12)：139-141.

Screening of 16 kinds of transgenic soybean strains by real-time fluorescence PCR method

QIAN Yunkai，GAO Fei，WANG Haiyang，CUI Zongyan，WU Xi，XIAO Yanxia

(Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Qinhuangdao 066004，Hebei,China)

16 kinds of transgenic soybean strains of 45 batches of transgenic soybean from two main ports for importation transgenic soybean in Hebei province Qinhuangdao port and Jingtang port were screened by real-time fluorescence PCR method(RT-PCR). The results showed that GTS-40-3-2 strains, MON89788 strains, A2704-12 strains,MON87701 strains and MON87701 × MON89788 strains were detected in transgenic soybean,and the detected batches were 45,30,14,2 and 1 respectively, which accounted for 100%, 66.7%,31.1%,4.4% and 2.2% of all the samples, respectively; other transgenic soybean strains were not detected in all the 45 batches of transgenic soybean. The screening of transgenic soybean strains from the main importation ports in Hebei province provided data support for importation controls of transgenic soybean strains in China.

transgenic soybean; real-time fluorescence PCR; importation; strain

表4 主要大豆進(jìn)口國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆品系檢測(cè)結(jié)果

2016-05-13；

2016-11-07

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015IK109，2015IK228)

錢云開(1982)，男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锇踩?E-mail)qyk-1@163.com。

王海洋，高級(jí)工程師，碩士(E-mail)lab086@163.com。

TS222;S502.3

A

1003-7969(2017)02-0141-05