淫羊藿苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備及活性研究

南敏倫于 淼趙昱瑋司學(xué)玲呂 娜赫玉芳*

（1 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；2 長(zhǎng)春三德天晟科技有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012；3 修正藥業(yè)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，吉林 長(zhǎng)春130012；4 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118）

淫羊藿苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備及活性研究

南敏倫1于 淼2趙昱瑋1司學(xué)玲3呂 娜4赫玉芳1*

（1 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；2 長(zhǎng)春三德天晟科技有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012；3 修正藥業(yè)長(zhǎng)春高新制藥有限公司，吉林 長(zhǎng)春130012；4 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118）

目的 旨在分析淫羊藿苷及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究。方法 對(duì)淫羊藿苷進(jìn)行酶水解、酸水解、酶水解與酸水解相結(jié)合的方式進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，采用薄層色譜法、理化方法、核磁共振波譜法對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分別得到淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、水合淫羊藿素、環(huán)淫羊藿素及脫水淫羊藿素。采用pNPG法建立α-葡萄糖苷酶篩選模型，對(duì)淫羊藿苷及其產(chǎn)物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選。結(jié)果 體外活性試驗(yàn)果表明，脫水淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ體外活性較淫羊藿苷好，其中脫水淫羊藿素（IC50=0.102 mg/mL）的活性最好，與拜糖平（IC50=0.850 mg/mL）相比抑制活性更強(qiáng)。結(jié)論 淫羊藿苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可作為繼續(xù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的先導(dǎo)化合物，具有深入研究和開(kāi)發(fā)的前景。

淫羊藿苷；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；α-葡萄糖苷酶；活性

α-葡萄糖苷酶主要分布于小腸的上皮絨毛膜刷狀上，對(duì)糖的分解及代謝具有十分重要作用。當(dāng)α-葡萄糖苷酶的活性受到抑制后，食物中多糖、雙糖向單糖的轉(zhuǎn)化速率就降低，從而有效的延緩糖的吸收，改善糖耐量，有效的控制并降低血糖的作用，同時(shí)可以提高糖耐量，具有預(yù)防和治療糖尿病及并發(fā)癥的特點(diǎn)[1]。

淫羊藿（Epimedii Folium）為小檗科淫羊藿屬植物，又名三枝九葉草、仙靈脾等。性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，用于治療風(fēng)濕痹痛、筋骨痿軟、腎陽(yáng)虛衰、陽(yáng)痿遺精、麻木拘攣等癥[2-3]。淫羊藿苷是主要黃酮類(lèi)成分，文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿苷具有降血糖活性，本文擬對(duì)淫羊藿苷進(jìn)行酸水解、酶水解、酸水解與酶水解相結(jié)合的手段得到淫羊藿苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。通過(guò)體外活性研究獲得高活性的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，為深入研究和開(kāi)發(fā)α-葡萄糖苷酶抑制劑提供依據(jù)，并且為進(jìn)一步研究各個(gè)化合物的活性基團(tuán)提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑：淫羊藿苷，自制（純度＞95%）；蝸牛酶（sigma公司）；pNPG（Merck公司）；4-硝基苯酚（PNP）（sigma公司）；酵母來(lái)源α-葡萄糖苷酶（sigma公司）；拜糖平（拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)）；C18 ODS（北京綠百草科技發(fā)展有限公司）；水為自制超純水；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備：酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；BS124S型電子天平（賽多利斯有限公司）；高效液相色譜儀（日立公司）；熔點(diǎn)測(cè)定儀（Yanacomicrometer）；液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定儀（Angilent1100LC/MSD）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 化合物Ⅰ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，用乙醇25 mL溶解，加入5%稀硫酸25 mL，50 ℃攪拌24 h，放至室溫，加入去離子水25 mL，攪拌，過(guò)濾，濾餅用去離子水洗至中性，干燥，得粗品；再用甲醇5 mL溶解，通過(guò)常壓ODS柱（4.0 cm×40 cm）進(jìn)行分離，以乙腈-水（45∶55）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，薄層檢測(cè)，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過(guò)濾，得到化合物Ⅰ 68.5 mg，收率為87.3%。

2.2 化合物Ⅱ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，用DMSO 1.0 mL溶解，加入醋酸-醋酸銨緩沖液（pH為6.0）100 mL，蝸牛酶0.2 g，37 ℃保溫反應(yīng)，以TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，離心，沉淀反復(fù)用水洗脫，干燥，得粗品；再用甲醇5 mL溶解，通過(guò)常壓ODS柱（4.0 cm×40 cm）進(jìn)行分離，以乙腈-水（45∶55）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，薄層檢測(cè)，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過(guò)濾，得到化合物Ⅱ58.6 mg，收率為77.1%。

2.3 化合物Ⅲ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，加入25 mL 2 mol/L的鹽酸溶液，攪拌，緩慢升溫至80 ℃，反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，放置4～8 h，過(guò)濾，濾餅用去離子水洗至中性，干燥，得酸反應(yīng)產(chǎn)物；將上述的酸反應(yīng)產(chǎn)物加至醋酸-醋酸銨緩沖液（pH為6.0）100 mL中，加入蝸牛酶0.2 g，37 ℃保溫反應(yīng)，以TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，離心，沉淀反復(fù)用水洗脫，干燥，得粗品；再用甲醇5 mL溶解，通過(guò)常壓ODS柱（4.0 cm×40 cm）進(jìn)行分離，以乙腈-水（70∶30）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，薄層檢測(cè)，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過(guò)濾，得到化合物Ⅲ48.6 mg，收率為85.1%。

2.4 化合物Ⅳ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，加入5 mol/L的硫酸溶液25 mL和80%冰醋酸溶液30 mL的混合溶液，攪拌，緩慢升溫至85 ℃，反應(yīng)72 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，先用10%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為6.0，接著用乙醚萃取3次，每次100 mL，合并乙醚液，利用無(wú)水硫酸鈉對(duì)溶劑進(jìn)行脫水，回收溶劑，甲醇重結(jié)晶，得到化合物Ⅳ49.2 mg，收率為90.4%。

2.5 化合物Ⅴ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，用乙醇25 mL溶解，加入5%稀硫酸25 mL，50 ℃攪拌24 h，放至室溫，加入去離子水25 mL，攪拌，過(guò)濾，濾餅用去離子水洗至中性，干燥，干燥物用DMSO 1.0 mL溶解，加入醋酸-醋酸銨緩沖液（pH為6.0）100 mL，蝸牛酶0.2 g，37 ℃保溫反應(yīng)，以TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，離心，沉淀反復(fù)用水洗脫，干燥；將干燥物用甲醇5 mL溶解，通過(guò)常壓ODS柱（4.0 cm× 40 cm）進(jìn)行分離，以乙腈-水（70∶30）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，薄層檢測(cè)，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過(guò)濾，得到化合物Ⅴ47.5 mg，收率為87.3%。

2.6 α-葡萄糖苷酶抑制劑活性測(cè)定

2.6.1 檢測(cè)方法：參考文獻(xiàn)[4]的測(cè)定方法，向96孔板中加入pH = 6.86的PB緩沖液30 μL，1.0 mg/mL還原型谷胱甘肽溶液10 μL，α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，37 ℃保溫10 min后，加入將要測(cè)定的樣品20 μL，5 mmol/L PNPG溶液20 μL，在37 ℃條件下反應(yīng)20 min后加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液100 μL使反應(yīng)終止，測(cè)定405 nm處光吸收值。同時(shí)設(shè)立背景對(duì)照組和空白組。

表1 淫羊藿苷及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、拜糖平對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性

抑制率（%）＝[A空白-（A樣品-A背景）]/A空白×100%。計(jì)算公式中A空白為不加樣品反應(yīng)結(jié)束后的吸光度值；A樣品為既加樣品又加酶反應(yīng)結(jié)束后的吸光度值；A背景為只加樣品反應(yīng)結(jié)束后的吸光度值。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：用pH為6.8的PB緩沖液配制50 mmol/L PNP，稀釋成5、2、1.0、0.5、0.25、0.1 mmol/L。分別取6種不同濃度的PNP溶液各100 μL加入到96孔板中，再加入0.2 moL/L Na2CO3溶液100 μL，振蕩混勻，在405 nm 條件下測(cè)定吸光度值，本實(shí)驗(yàn)中測(cè)3組取其平均值。以吸光度的值為縱坐標(biāo)，PNP濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定：向96孔板中加入pH=6.86的PB緩沖液35 μL，1.0 mg/mL還原型谷胱甘肽溶液10 μL，α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，DMSO 15 μL，37 ℃保溫10 min后，加入5 mmol/L pNPG溶液20 μL，在37 ℃條件下反應(yīng)20 min后加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液100 μL使反應(yīng)終止，測(cè)定405 nm處光吸收值。

酶活力單位定義：37 ℃，pH為6.86的條件下，每分鐘水解pNPG所產(chǎn)生1 μmoL PNP的酶量，規(guī)定為1個(gè)酶活力單位（U）[5]。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)檢定：結(jié)合常規(guī)理化、核磁、質(zhì)譜等分析測(cè)試方法對(duì)化合物Ⅰ～Ⅴ進(jìn)行了鑒定，分別為淫羊藿次苷Ⅰ[6]、淫羊藿次苷Ⅱ[7]、水合淫羊藿素[7]、環(huán)淫羊藿素[7]、脫水淫羊藿素[7]。

3.2 淫羊藿苷及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性作用的比較：表1顯示，各化合物分別在0.5 mg/mL和2.5 mg/mL濃度下，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，除環(huán)淫羊藿素和水合淫羊藿素外，其余均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制活性。脫水淫羊藿素（IC50=0.102 mg/mL）的活性最好，且高于拜糖平（IC50=0.850 mg/mL）的活性。見(jiàn)圖1。

圖1 淫羊藿苷及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

4 結(jié) 論

首次利用體外抑制α-葡萄糖苷酶活性篩選模型對(duì)淫羊藿苷及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果表明，淫羊藿苷及化合物Ⅰ～Ⅴ均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果表明脫水淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ體外活性較淫羊藿苷好，水合淫羊藿素及環(huán)淫羊藿素的活性最差，脫水淫羊藿素（IC50=0.102 mg/mL）的活性最好，其活性較拜糖平（IC50=0.850 mg/mL）的活性更好，在較低的濃度下，能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

以PNPG為底物進(jìn)行篩選中藥提取物或活性化合物，是目前最經(jīng)典也是最常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法[8-12]。整個(gè)過(guò)程快捷、經(jīng)濟(jì)，特別適合用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的初步篩選。本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶的活性及影響酶活性的因素（溫度、放置時(shí)間、DMSO的加入量）進(jìn)行了考察，同時(shí)，也對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系有影響的因素終止劑的加入量、孵育時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間、酶濃度、反應(yīng)底物的濃度進(jìn)行了考察，得到穩(wěn)定、科學(xué)合理的反應(yīng)模型。以陽(yáng)性對(duì)照藥拜糖平為對(duì)照，對(duì)模型進(jìn)行了驗(yàn)證，保證了反應(yīng)體系的科學(xué)性。

淫羊藿為我過(guò)傳統(tǒng)中藥材，在中醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛。作者的研究結(jié)果對(duì)傳統(tǒng)中藥淫羊藿及淫羊藿苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在糖尿病治療方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

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R282.710.3

B

1671-8194（2017）01-0019-02

吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2014-Q39）

*通訊作者：E-mail:hyf_1992@163.com