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    小體積液液萃取-GC/MS/MS法檢驗(yàn)血中非那西丁

    2017-05-14 08:49:10昱楊亮宋
    關(guān)鍵詞:離子流環(huán)己烷血樣

    朱 昱楊 亮宋 輝

    (1 中國(guó)刑事警察學(xué)院法化學(xué)系 遼寧 沈陽(yáng) 110035;2 成都市公安局青羊區(qū)分局 四川 成都 610013)

    小體積液液萃取-GC/MS/MS法檢驗(yàn)血中非那西丁

    朱 昱1楊 亮2宋 輝1

    (1 中國(guó)刑事警察學(xué)院法化學(xué)系 遼寧 沈陽(yáng) 110035;2 成都市公安局青羊區(qū)分局 四川 成都 610013)

    建立血中非那西丁的小體積液液萃取-GC/MS/MS分析檢驗(yàn)方法。血樣中的非那西丁用小體積的環(huán)己烷萃取后,采用GC/MS/MS方法進(jìn)行定性和定量分析。方法的樣品萃取率為83.2%,檢出限(LOD)為11.5ng/mL,定量限(LOQ)為38.5ng/mL,RSD為5.6%;平均相對(duì)回收率為98.9%。所建立的方法集分析物的提取和富集于一體,簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏,專屬性強(qiáng),為中毒案件中血中非那西丁的檢驗(yàn)提供了可靠的方法。

    非那西丁 氣相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用 血

    1 引言

    非那西丁屬乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛劑,通常與其他藥物配成復(fù)方制劑,是去痛片和消炎痛的組分之一。此外,非那西丁還作為毒品添加成分。近年來(lái),服用去痛片自殺和去痛片過(guò)量服用造成用藥者中毒的案件時(shí)有發(fā)生。非那西丁是去痛片的主要成分之一,在此類中毒案件中,常需要進(jìn)行中毒者血中非那西丁的檢測(cè)。

    目前,血樣中非那西丁的GC/MS法分析,國(guó)外主要采用衍生化-GC/CIMS分析方法[1-2]分析血漿中的非那西丁,操作較為復(fù)雜;國(guó)內(nèi)GC/MS法檢測(cè)血中非那西丁曾有報(bào)道采用總離子流一級(jí)質(zhì)譜定性分析和選擇離子(SIM)掃描外標(biāo)法定量分析血中去痛片成分[3],或采用七氟丁酰氯(HFBC)衍生化-GC/MS/MS法分析血中非那西丁[4]。本論文在借鑒國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道的基礎(chǔ)上,研究建立了血中非那西丁的小體積液液萃取-GC/MS/MS分析方法。所建立的方法集分析物的提取和富集于一體,簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏,專屬性強(qiáng),滿足非那西丁中毒血樣檢驗(yàn)鑒定的要求。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 試劑

    非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取非那西丁(對(duì)照品,購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心),用甲醇配制成1.0mg/mL溶液。

    內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取SKF525A(購(gòu)自Sigma公司,純度≥95.0%),用甲醇配制成1.0mg/mL溶液。

    pH10.8碳酸鹽緩沖溶液:稱取無(wú)水碳酸鈉53.0g,碳酸氫鈉42.0g,加水定容至500mL。

    環(huán)己烷、氯化鈉,均為分析純。

    空白血為近期未服藥的健康人血。

    2.2 儀器及條件

    Thermo-Finnigan PolarisQ氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。

    GC條件:HP-5ms 熔融石英毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm i.d. ×0.25μm),柱溫:初始溫度60℃,保持1min,升溫速率20℃/min,至280℃恒溫10min;氣化溫度280℃;載氣:He,流量1min/mL;不分流進(jìn)樣。

    MS條件:EI電離源,電子束能量70eV,離子源溫度200℃;AGC自動(dòng)增益控制,倍增器電壓1350V;傳輸線溫度280℃;一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜SRM全掃描方式檢測(cè)(具體條件見(jiàn)下表)。

    2.3 實(shí)驗(yàn)方法

    取血樣5mL,加入內(nèi)標(biāo)SKF525A標(biāo)準(zhǔn)溶液5μL,混勻;加入1.5g氯化鈉至飽和,再加入1mL的pH10.8緩沖溶液,渦旋1min;加0.5mL環(huán)己烷,渦旋1min,振蕩混勻,10000r/min離心3min,取上層有機(jī)相1μL進(jìn)樣,按2.2儀器條件進(jìn)行GC/MS/MS分析,測(cè)定非那西丁和內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜總離子流(TIC)色譜和質(zhì)譜。根據(jù)特征母離子的二級(jí)質(zhì)譜特征離子及其質(zhì)量色譜的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜SRM色譜峰面積采用內(nèi)標(biāo)曲線法進(jìn)行定量分析。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 總離子流色譜(TIC)和質(zhì)譜

    3.1.1 非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A的一級(jí)質(zhì)譜MS1和二級(jí)質(zhì)譜MS2

    取非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.2儀器條件進(jìn)行GC/MS和GC/MS/MS分析,采集總離子流色譜、一級(jí)質(zhì)譜(MS1)和二級(jí)質(zhì)譜(MS2,母離子為一級(jí)質(zhì)譜的基峰)。非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A的TIC色譜峰保留時(shí)間(tR)分別為8.99min和12.08min。其MS1和MS2質(zhì)譜如圖1、圖2所示,MS2質(zhì)譜特征子離子如下表所示。

    表 一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜SRM全掃描檢測(cè)條件和特征離子

    3.1.2 空白添加血樣的GC/MS/MS總離子流色譜

    取空白血樣5mL,添加非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和SKF525A標(biāo)準(zhǔn)溶液各5μL,按2.3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和GC/MS/MS分析,其SRM二級(jí)質(zhì)譜的TIC色譜如圖3所示??梢?jiàn)非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A的GC/ MS/MS色譜峰分離良好且互不干擾。

    圖1 非那西丁和內(nèi)標(biāo)的MS1質(zhì)譜

    圖2 非那西丁和內(nèi)標(biāo)的MS2質(zhì)譜

    3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

    對(duì)于GC/MS/MS分析來(lái)說(shuō),較為理想的內(nèi)標(biāo)應(yīng)是分析物的氘代物。因此,國(guó)外已有的GC/MS法定量分析血中非那西丁的文獻(xiàn)中均采用氘代物做內(nèi)標(biāo)。但國(guó)內(nèi)氘代物來(lái)源較困難,且價(jià)格昂貴,分析成本較高。因此,本文選擇國(guó)內(nèi)公安毒物分析領(lǐng)域中定量分析堿性藥毒物常用的SKF525A做內(nèi)標(biāo)。

    圖3 空白添加血樣的SRM二級(jí)質(zhì)譜TIC色譜

    3.3 氣相色譜/質(zhì)譜分析方式的選擇

    在GC/MS一級(jí)質(zhì)譜全掃描方式檢測(cè)總離子流色譜中,血樣基體的響應(yīng)信號(hào)高,內(nèi)源性雜質(zhì)干擾較大,非那西丁色譜峰的信噪比較低,導(dǎo)致靈敏度降低,雖然采用選擇離子檢測(cè)(SIM)方式,可降低背景噪聲,提高靈敏度,但會(huì)降低質(zhì)譜的特異性,使定性的準(zhǔn)確性和可靠性下降。而在GC/MS/ MS總離子流色譜中,采用二級(jí)質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)檢測(cè)方式,可最大程度上消除了檢材基體和內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,顯著提高了檢測(cè)靈敏度;同時(shí)由于SRM子母離子相互配合印證,避免了一級(jí)質(zhì)譜SIM檢測(cè)方式的定性特異性差、抗干擾能力不強(qiáng)等缺點(diǎn)。因此,本文利用SRM監(jiān)測(cè)技術(shù),以非那西丁一級(jí)質(zhì)譜的基峰特征離子作為母離子,根據(jù)其二級(jí)質(zhì)譜的特征子離子進(jìn)行定性分析;利用二級(jí)質(zhì)譜的SRM色譜峰面積進(jìn)行定量分析。

    3.4 萃取方法、萃取溶劑和萃取率

    本文采用小體積液-液萃取方法對(duì)血中的非那西丁進(jìn)行提取。在萃取時(shí),采用0.5mL環(huán)己烷萃取5mL血中的非那西丁,使非那西丁由大體積(5mL)的水基質(zhì)血樣中轉(zhuǎn)移到小體積(0.5mL)的環(huán)己烷有機(jī)相中,集分析物的提取與富集于一體,不需對(duì)萃取液進(jìn)行濃縮。既簡(jiǎn)化了操作,又避免了萃取液濃縮所造成的分析物的損失。

    實(shí)驗(yàn)中對(duì)乙醚、環(huán)己烷、苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯作為萃取溶劑分別進(jìn)行了考察。結(jié)果表明乙酸乙酯、三氯甲烷的萃取率較高,分別為89.1%和88.3%,乙醚、環(huán)己烷、苯、二氯甲烷的萃取率接近分別為83.1%、83.2%、84.1%和83.8%,但乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、苯萃取時(shí)較易乳化,乙醚則揮發(fā)性太強(qiáng),萃取時(shí)由于溶劑體積小而容易揮干而分取困難,另外三氯甲烷和二氯甲烷萃取液位于水基質(zhì)血樣下層,不便分取。因此,選擇環(huán)己烷作為小體積萃取的溶劑。

    實(shí)驗(yàn)中在血樣中加入氯化鈉至飽和,使水基質(zhì)血樣和萃取劑有機(jī)相之間的比重差加大,有效地消除了萃取過(guò)程中的乳化現(xiàn)象。

    在空白血中加入1.0μg/mL的非那西丁,進(jìn)行萃取率測(cè)定試驗(yàn),根據(jù)經(jīng)萃取和未經(jīng)萃取樣品所測(cè)得的非那西丁與內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜SRM色譜峰面積比,計(jì)算非那西丁萃取率。結(jié)果測(cè)得非那西丁的平均萃取率E%=均值±SD=83.2%±5.5%(n=5)。

    3.5 檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

    本方法以非那西丁GC/MS/MS色譜峰信噪比為3時(shí)的信號(hào)值所對(duì)應(yīng)的血樣中非那西丁濃度為檢出限(limit of detection,LOD),以非那西丁色譜峰信噪比為10時(shí)的信號(hào)值所對(duì)應(yīng)的非那西丁濃度為定量限(limit of quantitation,LOQ)。 結(jié)果測(cè)得血樣中非那西丁的LOD為11.5ng/mL,LOQ為38.5ng/mL。

    3.6 內(nèi)標(biāo)工作曲線

    取5mL空白血若干份,制備不同濃度(0.05、0.25、1.0、5.0、10和50μg/mL)的非那西丁空白血添加系列,分別加內(nèi)標(biāo)SKF525A各1μg,按2.3方法進(jìn)行GC/MS/MS分析。以非那西丁的添加濃度(X,μg/mL)為橫坐標(biāo),非那西丁與內(nèi)標(biāo)SKF525A的二級(jí)質(zhì)譜SRM色譜峰面積比(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得內(nèi)標(biāo)工作曲線方程為y=0.3559x-0.0084,相關(guān)系數(shù)r=0.9993,呈良好的線性關(guān)系,線性范圍0.05~50μg/mL。

    3.7 準(zhǔn)確性和精密度

    取空白血制備非那西丁濃度為1.0μg/mL的添加血樣,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn),測(cè)定相對(duì)回收率,計(jì)算平均相對(duì)回收率和RSD(n=5),結(jié)果血中非那西丁的平均相對(duì)回收率為98.9%,平均RSD為5.6%。

    3.8 方法的專屬性

    取空白血樣,按2.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和GC/MS/MS分析。結(jié)果表明,空白血的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾分析物的測(cè)定。

    4 服藥自愿者血樣檢測(cè)

    一健康男性,25歲,口服治療量去痛片2小時(shí)后采集血液,用本文方法測(cè)定血樣中非那西丁濃度為3.1μg/mL。表明本方法滿足司法檢驗(yàn)鑒定的要求。

    [1]Murray S, Boobis AR. Combined assay for phenacetin and paracetamol in plasma using capillary column gas chromatography-negative-ion mass spectrometry[J]. J. Chromatogr. A,1991(2):341-350.

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    [3]王皓玉,等.血中去痛片有效成分的分析[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007(6): 518-522.

    [4]楊亮,等.血中非那西丁的GC/MS檢測(cè)[J].廣東化工,2014(24):108-110.

    (責(zé)任編輯:孟凡騫)

    R991;O657.63

    A

    2095-7939(2017)02-0100-03

    10.14060/j.issn.2095-7939.2017.02.020

    2016-11-29

    朱昱(1964-),男,遼寧沈陽(yáng)人,中國(guó)刑事警察學(xué)院法化學(xué)系教授,主要從事毒物毒品分析研究。

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