MPure-12 全自動核酸純化儀與Chelex-100 法的比較

盛翔，李敏，王亞麗，陳玉玲，林源，趙珍敏，闕庭志

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325000；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；5.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

·技術(shù)與應(yīng)用·

MPure-12 全自動核酸純化儀與Chelex-100 法的比較

盛翔1，2，李敏2，3，王亞麗2，4，陳玉玲2，5，林源2，趙珍敏2，闕庭志2

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325000；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；5.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

目的通過對DNA含量不同的血痕和多種類型生物學(xué)檢材進(jìn)行DNA提取和STR分型檢測，探討MPure-12全自動核酸純化儀（MPure-12法）在DNA提取中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。方法收集血痕、精斑、唾液等9種類型的生物學(xué)檢材，應(yīng)用MPure-12法和傳統(tǒng)Chelex-100法提取DNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和電泳，獲取STR分型圖譜。結(jié)果MPure-12法對發(fā)根、口香糖、煙蒂、肌肉組織、唾液斑、血痕、精斑這些檢材能夠成功分型，唾液出現(xiàn)了個別等位基因丟失現(xiàn)象，接觸拭子分型較差。Chelex-100法對血量為20μL、15μL、10μL、5μL、1μL制成的血痕均有完整分型結(jié)果，MPure-12法在血量為1μL時出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象。結(jié)論MPure-12法適用于一定濃度血樣的檢驗(yàn)，而對于微量血樣，Chelex-100法提取DNA的效果可能更優(yōu)。儀器應(yīng)用于DNA提取具有操作簡單、快速、提取效率高，分型成功率高，減少人為污染等優(yōu)勢。

法醫(yī)遺傳學(xué)；提取法；自動化，實(shí)驗(yàn)室；MPure-12全自動核酸純化儀；Chelex-100法

目前，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用DNA技術(shù)提供線索和證據(jù)的過程中，快速、高效地獲取高質(zhì)量的DNA模板是進(jìn)行DNA有效擴(kuò)增并獲得準(zhǔn)確分型的重要保障[1]。同時，DNA檢測結(jié)果越來越多地被用作法庭證據(jù)，使用自動化提取系統(tǒng)可以減少人為因素的影響，提高檢測結(jié)果的科學(xué)性。本研究采用MPure-12全自動核酸純化儀（簡稱MPure-12法）和傳統(tǒng)Chelex-100提取法對9種類型檢材及不同血量的血痕DNA進(jìn)行提取，探究MPure-12法在DNA提取中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

4名志愿者，每人提供發(fā)根、口香糖樣本、接觸拭子（手掌）、唾液、煙蒂5類檢材，共20份，均在知情同意的情況下采集。

9份日常檢案中積累的檢材，共4類，包括血痕4份、肌肉組織樣本3份、精斑1份、唾液斑1份。

另招募1名志愿者，采集外周血，按20μL、15μL、10μL、5μL、1μL的血量一式兩份制成血痕，載體為FTA卡。

1.2 主要儀器與試劑

MPure-12全自動核酸純化儀及配套耗材（新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司），9700型PCR擴(kuò)增儀和3130XL型遺傳分析儀（美國AB公司），5417R離心機(jī)和5430離心機(jī)（德國Eppendorf公司），Epoch超微量微孔板分光光度計(jì)（美國伯騰儀器有限公司）。

Chelex-100混懸液及去離子甲酰胺（美國AB公司），Golden e yeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］，DNA標(biāo)準(zhǔn)品9947A和9948（美國Promega公司）

1.3 DNA提取

采用MPure-12法提取所有檢材DNA。前處理方法如下：取適量檢材于1.5mL離心管中（不同血量的血痕需要全部剪?。?，加入BL2緩沖液及蛋白酶K，56℃恒溫水浴15min（發(fā)根和肌肉組織孵育過夜）。將發(fā)根、接觸拭子、血痕、肌肉組織及精斑樣本全部轉(zhuǎn)移至樣本管的過濾柱中，以離心半徑4.3 cm，500 r/min，離心1min，取樣本管中濾液進(jìn)行DNA自動化提??；口香糖、唾液、煙蒂和唾液斑樣本在孵育后短暫離心，直接取上清液進(jìn)行核酸提取。按照儀器操作說明將耗材放入MPure-12全自動核酸純化儀的對應(yīng)位置，吸取經(jīng)前處理的樣本各200μL加入樣品管，然后用條碼讀取器讀取純化方法條形碼，選取樣本量200μL、洗脫量50μL，儀器開始進(jìn)行自動化提取。每份檢材進(jìn)行兩次平行試驗(yàn)。

采用Chelex-100法提取4名志愿者的發(fā)根樣本、檢案積累的檢材以及不同血量的血痕DNA。剪取適量檢材（不同血量的血痕需要全部剪取）放入1.5mL離心管中，加1mL純水，振蕩10 s，室溫放置30min，以離心半徑4.3cm，14000 r/min，離心6min，棄上清液，加入適量10%Chelex-100溶液和蛋白酶K，56℃孵育30min，煮沸8min，以離心半徑4.3cm，14000 r/min，離心6min，上清液進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.4 PCR擴(kuò)增與STR分型

擴(kuò)增前使用分光光度計(jì)對MPure-12法提取的樣本DNA進(jìn)行定量。定量結(jié)果顯示，從發(fā)根樣本提取的DNA質(zhì)量濃度為18～22ng/μL，從肌肉組織提取的DNA質(zhì)量濃度為171～300ng/μL。擴(kuò)增前對這兩種檢材提取的DNA進(jìn)行稀釋，稀釋后質(zhì)量濃度為2ng/μL；其余類型樣本提取的DNA質(zhì)量濃度在0.5～5 ng/μL范圍內(nèi)，可直接用于PCR反應(yīng)。Chelex-100法提取的樣本直接吸取1μL上清液進(jìn)行PCR反應(yīng)。

應(yīng)用Golden e yeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增[2]?？倲U(kuò)增體系為10μL，包括4μL 2.5×PCR反應(yīng)緩沖液Ⅱ、2μL 5×22NC引物混合物、0.2μL Taq聚合酶、DNA模板1～10ng。PCR反應(yīng)采用30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130XL型遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用GeneMapper ID v3.2.1軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Mpure-12法提取9類檢材DNA的分型結(jié)果統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如下：

（1）以Chelex-100法提取的4名志愿者發(fā)根樣本、檢案積累檢材的DNA完整分型圖譜作為陽性對照。

（3）平均基因座檢出率根據(jù)平均檢出基因座個數(shù)與試劑盒包含的基因座個數(shù)的比值獲得，分型結(jié)果統(tǒng)計(jì)去除性別基因座（Amelogenin）。

（4）檢材經(jīng)Mpure-12法提取、擴(kuò)增及分型后，取平均值統(tǒng)計(jì)。

分別運(yùn)用Mpure-12法和Chelex-100法提取不同血量的血痕DNA，應(yīng)用Golden e yeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC試劑盒分型，對兩種方法的分型結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 9類檢材的分型結(jié)果

Mpure-12法提取9類檢材的DNA分型結(jié)果見表1。

表1 9類檢材的基因座平均檢出個數(shù)及平均檢出率

2.2 Chelex-100法與MPure-12法提取DNA的分型比較

Chelex-100法對血量分別為20μL、15μL、10μL、5μL、1μL制成的血痕均有完整分型。

MPure-12法對血量為5～20μL的血痕提取的DNA有完整分型結(jié)果，且等位基因峰高的平均RFU值高于Chelex-100法；當(dāng)血量為1μL時出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，具體分型信息見表2。

表2 Chelex-100法和MPure-12法提取不同血量的血痕DNA的分型結(jié)果

3 討論

近年來，隨著法醫(yī)學(xué)檢材的DNA檢測結(jié)果被廣泛應(yīng)用于法庭科學(xué)及親子鑒定證據(jù)，科學(xué)、準(zhǔn)確的分型結(jié)果顯得尤為重要，而生物檢材的DNA提取是DNA檢驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵一步。本研究結(jié)果顯示，MPure-12法對7類檢材（發(fā)根、口香糖、煙蒂、血痕、肌肉組織、唾液斑、精斑）的基因座檢出率達(dá)100%；唾液檢材出現(xiàn)個別等位基因丟失現(xiàn)象。9類檢材Amelogenin基因均可準(zhǔn)確分型。接觸拭子提取結(jié)果不理想，平均基因座檢出率只有23.8%。黃慧等[4]運(yùn)用Chelex-100法、直接擴(kuò)增法、磁珠法提取90份日常案件中常見接觸性檢材的DNA，三種方法的檢出率分別為58%、72%、81%。胡麗梅等[5]采用DNA IQTMsystem對口罩、手套、衣物類檢材的檢出率為72.72%。分析本研究結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，接觸類檢材檢出率較低，主要因?yàn)榻佑|DNA量少、體積小、肉眼不易觀察。本研究接觸檢材檢出率較文獻(xiàn)報(bào)道更低，考慮本研究中接觸樣本數(shù)量少，取材局限，后續(xù)需要對接觸DNA提取檢出率再驗(yàn)證。

兩種方法提取的DNA分型結(jié)果表明，DNA含量較高（實(shí)驗(yàn)中血量＞5μL）時，Chelex-100法和MPure-12法均可成功分型，但MPure-12法提取的DNA分型的平均RFU值高于Chelex-100法，說明自動化提取的DNA相對濃度較高；當(dāng)樣本中DNA含量很低（實(shí)驗(yàn)中血量為1μL）時，常規(guī)Chelex-100法要優(yōu)于MPure-12法，可能由于Chelex-100法提取DNA的過程是在同一管中操作，因此檢材的損失率低，相對不容易污染[6]。

匡金枝等[7]參照標(biāo)準(zhǔn)DNA IQTM磁珠法操作流程，在Freedom EVO 100-4工作站配置模塊，設(shè)計(jì)、優(yōu)化并裝載工作站-磁珠法DNA自動提取程序，對各類涉案生物檢材（共計(jì)1 552例）進(jìn)行DNA提取并獲取STR分型，檢測成功率為血斑（98.9%）、精斑（98.6%）、毛發(fā)（65.2%）、煙蒂（98.5%）、組織（88.0%）、接觸脫落細(xì)胞（71.2%），對于接觸拭子的分型成功率明顯優(yōu)于本研究結(jié)果，而其他類型樣本分型成功率則不如本研究。兩種自動提取工作站均采用磁珠分離技術(shù)，通過磁性硅膠細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，從細(xì)胞中游離出來的核酸分子被特異地吸附到磁性顆粒表面，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附從而留在溶液中，大大提高了核酸提取的純度和濃度，減少了PCR反應(yīng)的抑制物。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異的原因：（1）樣本數(shù)量。相比文獻(xiàn)報(bào)道的1552例檢材，本研究中檢材數(shù)量少。（2）樣本取材途徑不同。文獻(xiàn)樣本來自現(xiàn)場，DNA含量差異大，影響因素較多，保存方式、環(huán)境、污染、載體類型都會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響；本研究樣本是模擬現(xiàn)場檢材。

綜上所述，MPure-12全自動核酸純化儀有配套耗材及試劑，操作簡單，通過掃描條形碼設(shè)定實(shí)驗(yàn)方法、上樣量和洗脫量，前處理簡單省時，樣品的裂解、DNA吸附、洗滌、洗脫等步驟均在自動化工作站中完成，減少了交叉污染及人為操作失誤和污染等問題。本研究對多種法醫(yī)學(xué)檢材均有涉及，但由于樣本量少，檢出率及儀器靈敏度檢測有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]孫敬，趙興春，姜伯瑋，等.法醫(yī)DNA提取純化試劑盒在MP-120自動化工作站上提取案件樣本DNA的性能研究[J].生命科學(xué)儀器，2010，8（1）：34-36.

[2]林源，闕庭志，趙珍敏，等.Golden e yeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC試劑盒的法醫(yī)遺傳學(xué)調(diào)查[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（4）：280-283.

[3]侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：139.

[4]黃慧，何宗師.三種檢驗(yàn)方法在接觸性檢材中比較及應(yīng)用[J].黑龍江科技信息，2016，（28）：119.

[5]胡麗梅，張瑞，鄒軍根.接觸性生物檢材DNA提取方法的比較[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（3）：215-216.

[6]廖長青，成靜，劉維.Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗(yàn)中的比較[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（2）：148-149.

[7]匡金枝，聶同鋼，楊智，等.法醫(yī)物證DNA自動化檢驗(yàn)技術(shù)體系的研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（3）：164-167.

Com parison of MPure-12 Automatic Nucleic Acid Purification and Chelex-100 M ethod

SHENG Xiang1,2,LI Min2,3,WANG Ya-li2,4,CHEN Yu-ling2,5,LIN Yuan2,ZHAO Zhen-min2,QUE Ting-zhi2
（1.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science, Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China;3.School of Basic Medical Sciences,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China;4.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medical Sciences, Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010020,China;5.School of Biotechnology,East China University of Science and Technology,State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,Shanghai 200237,China）

ObjectiveTo explore the forensic application value of MPure-12 automatic nucleic acid purification（MPure-12 Method）for DNA extraction by extracting and typing DNA from bloodstains and various kinds of biological samples w ith different DNA contents.MethodsNine types of biological samples,such as bloodstains,sem en stains,and saliva were collected.DNA were extracted using MPure-12 method and Chelex-100 method,followed by PCR amplification and electrophoresis for obtaining STR-profiles.ResultsThe samples such as hair root,chutty,butt,muscular tissue,saliva stain,bloodstain and semen stain were typed successfully by MPure-12 method.Partial alleles were lacked in the samples of saliva,and the genotyping of contact swabs was unsatisfactory.Additional,all of the bloodstains（20μL, 15μL,10μL,5μL,1μL）showed good typing results using Chelex-100 method.But the loss of alleles occurred in 1μL blood volume by MPure-12 method.ConclusionMPure-12 method is suitable for DNA extraction of a certain concentration blood samples．Chelex-100 method may be better for the extraction of trace blood samples．This instrument used in nucleic acid extraction has the advantages of simplicity of operator,rapidity,high extraction efficiency,high rate of reportable STR-profiles and lower man-made pollution.

forensic genetics;extraction;automation,laboratory;MPure-12 automatic nucleic acid purification;Chelex-100 method

DF795.2

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.013

1004-5619（2017）02-0168-03

2016-06-30）

（本文編輯：張素華）

十三五國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC0800703)；中央級科研院所公益資助項(xiàng)目（GY2014G-4，GY2017D-2）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺資助項(xiàng)目（16DZ2290900）

盛翔（1991—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：dreamer_sx0926@163.com

闕庭志，男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：quetz@ssfjd.cn