血紅蛋白研究
——近、現(xiàn)代生命科學發(fā)展的一個微觀縮影

任衍鋼 白冠軍 宋玉奇 衛(wèi)紅萍

（陽泉師范高等?？茖W校 山西平定 045200）

血紅蛋白是研究生物化學和分子生物學的重要實驗材料，是闡述生命大分子結構和功能的經(jīng)典物質(zhì)。血紅蛋白是人類最早推測出分子量的蛋白質(zhì)，也是人類最早較系統(tǒng)地闡明結構和功能的生命類重要化合物，最早人類分子病發(fā)生的原因闡明即是基于對血紅蛋白的研究。本文簡要回顧從血紅蛋白發(fā)現(xiàn)到其分子結構和生理機制揭示的歷史過程。

1 血紅蛋白的發(fā)現(xiàn)與早期的研究

對血紅蛋白的研究最早可追溯到1825年?；瘜W家恩格爾哈德（Johann Friedrich Engelhard）發(fā)現(xiàn)動物血紅蛋白中鐵的比例總是恒定的。根據(jù)鐵原子的質(zhì)量，他計算出血紅蛋白的分子量為4×16 000。這是歷史上首次確定的蛋白質(zhì)分子量。這個“草率的結論”在當時遭到其他學者的嘲笑，他們不相信任何分子的分子量會如此大。1925年是恩格爾哈德推測血紅蛋白分子量100周年，英國科學家代爾（Gilbert Smithson Adair）用 1877年德國植物學家菲費爾（Wilhelm Pfeffer)發(fā)明的滲透壓測定大分子量的方法證實了恩格爾哈德的結果。代爾還預測血紅蛋白分子是一個四聚體化合物，其意義在于首先證實了蛋白質(zhì)大分子內(nèi)部不都是通過共價鍵相結合的。

1.1 血紅素的發(fā)現(xiàn)——從有機化學開始早在1746年，意大利學者梅紐因（Vincenzo Menghini）用含有磁力的刀片檢測到動物器官燃燒后形成的灰分中含有鐵元素。他發(fā)現(xiàn)將動物器官內(nèi)的血液析出后鐵元素的量會減少，由此推測血液中含有鐵元素。梅紐因還通過將血液分離成3部分的實驗證實，鐵元素主要存在于血紅細胞之中［1］。1831年，法國化學家勒卡努（Louis René Lecanu）在研究血液呈現(xiàn)顏色的原因時，發(fā)現(xiàn)血液的顏色與血紅蛋白有關。他將血紅蛋白分解成2個部分后，發(fā)現(xiàn)了一種僅占血紅蛋白4%的物質(zhì)。通過實驗進一步發(fā)現(xiàn)該化合物中含有鐵。為此，他采用法國化學家謝弗勒爾（Chevreul Michel Eugene）給予的名字 “hematosine”（高鐵血紅素，現(xiàn)稱為血紅素）進行命名［2］。隨后科學家發(fā)現(xiàn)，血紅素除去鐵離子后，剩余部分可進一步分裂成大致相當于血紅素1/4大小的碎片，這些碎片后被鑒定是吡咯（吡咯最早是從煤焦油中提取的）。吡咯如何組成血紅素？直到20世紀20年代這項工作才取得實質(zhì)性的突破。1921年德國科學家漢斯·費歇爾（Hans Fischer）在研究膽汁色素時發(fā)現(xiàn)，當把膽汁中的膽紅素分裂成一半時，在膽汁色素中就有血紅素的成分存在。同時他發(fā)現(xiàn)血紅素的結構與吡咯有一定的聯(lián)系，于是想到如果能將4個吡咯合在一起，也許就能發(fā)現(xiàn)血紅素的結構。不久，費歇爾成功地得到了一種四環(huán)化合物，并稱之為“卟吩”。由于分解血紅素時，吡咯是含有一些側鏈的，所以在合成卟吩時，也就形成了一些不同側鏈的卟吩衍生物，這些含側鏈的卟吩衍生物就有了一個新的名字：“卟啉”（“卟啉”一詞是其英文名稱porphyrin的音譯，其英文名源于希臘語單詞，意為紫色，因此卟啉也被稱作紫質(zhì)）。血色素是哪一種卟啉？費歇爾打算從他合成的15種卟啉化合物中挑選。經(jīng)過他和學生的反復比較和甄別，終于找出了與天然血色素一樣的卟啉。費歇爾由于在合成血色素方面杰出的貢獻，榮獲1930年的諾貝爾化學獎。此后，費歇爾將注意力轉(zhuǎn)移到研究葉綠素結構，通過多方面的研究，于1940年闡明了葉綠素a的結構。

1.2 血紅蛋白功能的發(fā)現(xiàn)——生物化學的奠定血紅蛋白晶體最早是由德國萊比錫大學生物化學家許內(nèi)費爾德（Friedrich Ludwig Hünefeld）于1840年發(fā)現(xiàn)的。他將蚯蚓的血液制成涂片放在顯微鏡下，觀察到了針狀多簇的晶體，經(jīng)分析確定，這是血紅蛋白形成的單晶結構（也有記載是觀察女性經(jīng)血）。這項研究開啟了蛋白質(zhì)晶體研究的先河［3］。 1851—1852 年，德國生理學家芬克（Otto Funke）發(fā)表了一系列通過用純水、酒精溶液、醇或醚溶劑以緩慢蒸發(fā)的方法從蛋白質(zhì)溶液獲得氧合血紅蛋白單晶結構的文章，為此，芬克被認為是蛋白質(zhì)晶體研究的先驅(qū)。隨后，德國生理學家霍普·塞勒（Felix Hoppe-Seyler）于 1866年在研究血紅細胞功能時，將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)化合物命名為hemoglobin或haemoglobin。英文血紅蛋白來自希臘語“haima”（血液）和“globule”（小球或水珠）。 霍普·塞勒還發(fā)現(xiàn)氧合血紅蛋白與非氧合血紅蛋白之間在吸收光譜的波段上存在差異，從而揭示了血紅蛋白與氧結合及分離的過程，并指出氧與血紅蛋白的結合是以分子而不是以原子形式進行的。為此，他又創(chuàng)造了氧合血紅蛋白這一術語（英文為oxyhemoglobin）。正是由于對血紅蛋白功能的認識，人類開始認識到血紅細胞的功能是運輸氧氣［注：血紅細胞最早是由荷蘭生物學家斯瓦默丹（Jan Swammerdam）于1658年用顯微鏡觀察蛙血時發(fā)現(xiàn)的。1674年，另一個荷蘭顯微學家列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）對紅血球進行了更加詳細的描述［4］］?；羝铡と者€發(fā)現(xiàn)一氧化碳也能與血紅蛋白穩(wěn)定結合。最早對一氧化碳毒性進行研究的是法國著名的生理學家克勞德·伯納德（Claude Bernard）。1846年，克勞德讓狗吸入這種氣體，發(fā)現(xiàn)狗的血液變成“櫻桃紅色”，即一氧化碳中毒癥狀，最早解釋了煤氣中毒的原因?？藙诘聦ρt蛋白研究的論文多達30余篇。其中一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，若在壓縮空氣下工作的工人突然回到正常狀態(tài)下，會由于血液中氧氣迅速的流失而引起死亡，而如果讓他們漸漸地回到正常的大氣壓下則會避免這種災難的發(fā)生，這一發(fā)現(xiàn)挽救了許多人的生命。他還說明了機體氧化的最終場所是機體組織而不是血液。作為生物化學的先驅(qū)，霍普·塞勒在1877年首先使用“生物化學（德語：biochemie。英文中的biochemistry首次出現(xiàn)在1848年）”一詞，標志著生物化學學科的誕生［5］。

2 血紅蛋白結構和機制的揭示——分子生物學的研究

由于血紅蛋白易于提取和結晶，并且與一些貧血癥狀有關，科學家對血紅蛋白的研究興趣愈發(fā)濃厚，從而使血紅蛋白成為揭開蛋白質(zhì)分子結構和功能的重要實驗材料。

2.1 血紅蛋白一級結構的研究——分子生物學的開端 血紅蛋白一級結構的揭示是對一種鐮刀型細胞貧血癥的疾病研究引發(fā)的。1910年，美國芝加哥醫(yī)生赫里克（James B.Herrick）注意到了一位來自加勒比海貧血癥患者，患者血液中的紅細胞呈現(xiàn)“鐮刀形”。1927 年，哈恩（E.V.Hahn）和吉萊斯皮（E.B.Gillespie）通過實驗證實鐮刀型貧血與缺氧有關［6］。1940年，著名科學家霍普金斯（Johns Hopkins）的學生謝爾曼（Irving Sherman）發(fā)現(xiàn)，脫氧紅細胞會出現(xiàn)雙折射現(xiàn)象，因而推測缺氧會使血紅蛋白改變形狀［7］。1948年，著名的美國科學家鮑林（Linus Pauling）和哈維·板野 （Harvey Itano）通過電泳技術分析方法發(fā)現(xiàn)鐮刀型細胞貧血癥患者的血紅蛋白與正常人存在差異，這使他們在1949年首次提出了分子病的概念，這也是人類發(fā)現(xiàn)的第1種分子疾病。正常血紅蛋白與鐮刀型血紅蛋白差異究竟在哪里？1959年，德籍美國科學家弗農(nóng)·英格拉姆（Vernon Ingram）揭開了這個謎底。英格拉姆發(fā)明了酶解圖譜法或稱指紋圖譜法的特殊紙上層析技術。該技術是先將血紅蛋白用胰蛋白酶水解，制成胰蛋白酶的水解產(chǎn)物，然后采取橫向和縱向的雙向分離方法將氨基酸盡可能都分開，這樣就發(fā)現(xiàn)在1個點上，正常血紅蛋白與鐮刀型血紅蛋白存在明顯差異。這個差異只是1個氨基酸，即正常的谷氨酸被異常的纈氨酸替代了，正可謂“差之毫厘謬以千里”，1個氨基酸的差錯就導致了鐮刀型貧血癥。緊接著英格拉姆用著名科學家桑格（Frederick Sanger）發(fā)明的測定胰島素一級結構氨基酸順序的方法，確定是血紅蛋白β鏈中從N端數(shù)第6個氨基酸谷氨酸被纈氨酸所取代。英格拉姆因其卓越的貢獻被科學界稱為分子醫(yī)學之父。此外，為了弄清血紅蛋白的一級結構，德國科學家布勞恩 （Gerhard Braunitzer）從1956年開始著手這項工作，經(jīng)過5年的努力，于1961年在莫斯科第5屆國際生化代表大會上宣讀了關于正常人血紅蛋白A化學組成的論文，并于同年發(fā)表在《Hopp-Seyler生理化學雜志》上，詳盡列出血紅蛋白A的α鏈 （141個氨基酸）、β鏈（146個氨基酸）和肌紅蛋白（155個氨基酸）等一級結構的全部氨基酸順序。由此闡明血紅蛋白A（α2β2）含有 574 個氨基酸，分子量為 64 450［8］。血紅蛋白一級結構的研究為分子生物學的研究提供了經(jīng)典案例，也為血紅蛋白空間結構的研究奠定了基礎。布勞恩也因其卓越貢獻被公認是分子生物學的先驅(qū)之一。

2.2 血紅蛋白空間結構的研究——分子生物學的深入 1951年，鮑林在研究血紅蛋白結構的基礎上，結合他對肽鏈和肽平面化學結構的理論，提出了α螺旋和β折疊的蛋白質(zhì)二級結構的理論（鮑林憑此杰出的貢獻榮獲了1954年的諾貝爾化學獎）。同年，英國科學家馬克斯·佩魯茨（Max Perutz）首次用X射線衍射的方法證實了鮑林的蛋白質(zhì)二級結構模型。1953年，佩魯茨發(fā)現(xiàn)，通過浸泡的方法可將重原子引入蛋白質(zhì)中，然后用同晶置換的方法就能解決多年一直未能解決的蛋白質(zhì)結構相位問題，這種方法為他們研究血紅蛋白空間結構提供了一個新途徑，并為以后更進一步確定蛋白質(zhì)空間結構邁出了關鍵一步，從而使對生物大分子的認識深入到了原子水平。1957年，在佩魯茨領導下從事研究的英國科學家約翰·肯德魯（John Kendrew）從鯨肌紅蛋白入手，對肌紅蛋白晶體的X射線衍射斑點進行分析。鑒于整個衍射圖涉及到幾萬個衍射斑點，他使用了當時最先進的計算機，確定了肌紅蛋白分子約2 600個原子的空間位置，并于1958年完成了肌紅蛋白結構的模型。佩魯茨從1937年開始便將研究重心放在血紅蛋白的結構上，并在1958年完成了血紅蛋白分辨率較低的三維結構的測定。由于肯德魯和佩魯茨杰出的貢獻，他們分享了1962年的諾貝爾化學獎。在獲得諾貝爾化學獎后，佩魯茨繼續(xù)研究血紅蛋白結構與功能的關系。1967年，佩魯茨完成了對血紅蛋白的高分率測定。這項工作從開始到完成歷時30年，終于畫上了圓滿句號［9］。血紅蛋白空間結構的測定，使科學家對血紅蛋白功能的了解更加深入。早在1938年，豪若威茲（Felix Haurowitz）就發(fā)現(xiàn)氧合血紅蛋白與脫氧血紅蛋白的晶體在結構上有差異［10］。1962年，佩魯茨等通過將脫氧血紅蛋白與氧合血紅蛋白的晶體比較后發(fā)現(xiàn)，氧合血紅蛋白與脫氧血紅蛋白的空間結構不同。在有氧條件下，血紅蛋白的四級結構會發(fā)生變化，2個α、β二聚體之間可以做相對位置的移動，氧合血紅蛋白比脫氧血紅蛋白的結合更加緊密。當氧合血紅蛋白失去氧時，它又緩慢地重新恢復到脫氧血紅蛋白的構象。由于血紅蛋白與氧的這種相互運動猶如肺的呼吸運動，因此有人稱之為“分子肺”。1970年，佩魯茨進一步發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白構象之間的互變有利于與氧的結合和釋放。當?shù)?個氧分子與血紅素上的鐵原子結合后，會促進其他氧分子與這個血紅蛋白中其他血紅素上的鐵原子結合；同樣，當?shù)?個氧分子從血紅素上釋放以后，會促進其他氧分子從這個血紅蛋白的其他血紅素上的釋放。但這種效應在單聚體和二聚體中都不發(fā)生，只有四聚體通過構象變化才表現(xiàn)這種協(xié)同作用。血紅蛋白的構象就是這樣在氧分壓高或低時進行亞基的運動，循環(huán)往復地進行［11］。25年后，約克大學蓋·多德森（Gug Dodson）教授的研究生瑪森姆·保利（Massime Paoli）證實了這一結論［12］。在評價佩魯茨的貢獻時，科學界認為，如果說DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)標志著現(xiàn)代生物學的開始，血紅蛋白分子結構的解析則標志著分子生物學的開端，佩魯茨被Nature等雜志尊稱為 “分子生物學之父”［13］。

還需要指出的是，20世紀90年代，科學家發(fā)現(xiàn)血紅蛋白中亞鐵血紅素附近的三級結構變化會引起二聚體間作用力的變化，進而導致四級結構發(fā)生可逆性的改變，并形成低氧合力和高氧合力之間的平衡［14］。近幾年，科學家發(fā)現(xiàn)，高海拔蜂鳥高親和性的血紅蛋白主要是由于2個氨基酸位置的突變，改變了血紅蛋白與氧的結合能力［15］?？傊?，血紅蛋白是脊椎動物高海拔低氧適應代謝通路上最重要、研究最多的功能蛋白，其本身的結構功能進化也代表一定的脊椎動物進化規(guī)律。

圖1 血紅蛋白變構平衡下的可逆氧結合（仿Projecto等［15］）

綜上所述，血紅蛋白研究的歷史是生物化學和分子生物學發(fā)展的一個微觀縮影。有關它的每一項研究，都見證了生物化學和分子生物學的進步，折射了近、現(xiàn)代生物學的發(fā)展歷程。生物化學與分子生物學既是生命科學的基礎，又是生命科學的前沿，是目前自然科學中發(fā)展最迅速、最具活力的前沿領域，二者在分子水平探討生命的本質(zhì)，前者側重于代謝與生理功能的聯(lián)系，后者側重于研究生命大分子的結構和功能。因此，分子生物學是從生物化學中深化和延伸出的一門重要的前沿學科，尤其是在分子生物學發(fā)展初期，對血紅蛋白質(zhì)結構和功能的研究起到了先導作用。

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