小麥蛋白對TGase酶交聯(lián)改性大豆蛋白凝膠特性的影響及機制

秦新生,姜紹通,趙妍嫣,鄭 志

(合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230009)

小麥蛋白對TGase酶交聯(lián)改性大豆蛋白凝膠特性的影響及機制

秦新生,姜紹通,趙妍嫣,鄭 志*

(合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230009)

為探討TGase酶對大豆與小麥混合蛋白凝膠性質(zhì)的影響,本文研究了小麥蛋白的加入前后混合蛋白凝膠功能性質(zhì)的變化規(guī)律。通過研究TGase酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH對混合蛋白凝膠特性的影響可知:蛋白濃度為11%(11 g/100 mL)保持不變,TGase酶添加量為30 U/g,反應(yīng)溫度為40 ℃,反應(yīng)pH為7.0時,TGase酶對混合蛋白凝膠特性改善效果最強。對比小麥蛋白加入前后蛋白凝膠的性質(zhì),發(fā)現(xiàn)小麥蛋白的添加使得蛋白結(jié)構(gòu)的β-折疊含量升高,游離巰基含量減少,凝膠彈性模量(G′)增強,形成了更為多空且緊密有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使得混合蛋白的凝膠性能顯著增強(p<0.05)。

大豆分離蛋白,小麥蛋白,TGase酶,凝膠性

大豆分離蛋白(SPI)蛋白質(zhì)含量在90%以上,具有豐富的營養(yǎng)價值,其氨基酸種類齊全,富含人體必需的賴氨酸,它的主要成分是7S和11S球蛋白。凝膠特性是大豆蛋白產(chǎn)品的一個重要功能性質(zhì),可直接應(yīng)用在豆制品、乳制品、肉制品等制作中[1-2]。小麥蛋白(谷朊粉,WG)是小麥淀粉加工的副產(chǎn)物,其蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)達75%左右,主要成分是麥谷蛋白和麥醇溶蛋白,是營養(yǎng)豐富的純天然植物蛋白源,但其第一限制性氨基酸是賴氨酸。由于小麥蛋白的組成以疏水性氨基酸為主,分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大,在水中分散性較差,溶解度較低,導(dǎo)致其凝膠性較弱且不穩(wěn)定,限制了其在食品中的大規(guī)模應(yīng)用[3]。

蛋白質(zhì)的凝膠特性是蛋白產(chǎn)品的重要評價指標(biāo)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TGase酶)通過催化蛋白質(zhì)或多肽中谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團與賴氨酸上的ε-氨基之間形成ε-(γ-glutamyl)lys共價鍵,發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成凝膠[4],從而改善了蛋白質(zhì)的各種性質(zhì),如粘彈性、保水性等。董建云等[5]研究發(fā)現(xiàn)通過TGase酶改性小麥蛋白可明顯提高其凝膠特性。Sun等[6]研究了TGase酶作用于豌豆分離蛋白和肌纖維蛋白,結(jié)果表明TGase酶對混合蛋白的溶解性、乳化性、凝膠強度等功能特性有所改善,并提高了其應(yīng)用范圍。由于大豆蛋白富含賴氨酸,而小麥蛋白含有豐富的谷氨酰胺,賴氨酸和谷氨酰胺作為TGase酶的作用底物,若將大豆蛋白和小麥蛋白混合進行TGase酶改性,不僅有助于形成凝膠,還可以平衡人體必需氨基酸結(jié)構(gòu),提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值[7-8]。

本文采用TGase酶交聯(lián)改性制備大豆分離蛋白和小麥混合蛋白凝膠,分析TGase酶添加量、反應(yīng)溫度、pH等因素對蛋白凝膠性質(zhì)的凝膠強度、持水性、溶解性的影響,并探討小麥蛋白的添加對混合蛋白凝膠的功能性質(zhì)(流變性、游離巰基含量、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu))變化的影響,為開發(fā)大豆和小麥復(fù)合蛋白的加工和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)含量>90%) 河南省鯤華生物技術(shù)有限公司;小麥蛋白(蛋白質(zhì)含量>75%) 安徽瑞福祥食品有限公司;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(酶活力為1000 U/g) 泰州市一鳴生物制品有限公司;其他試劑 均為分析純。

722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;himac CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本HITACHI公司;TA-XT plus物性測定儀 英國Stable Mciro System公司;JSM-6490LV型掃描電子顯微鏡 日本電子公司;Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司;DHR-3型旋轉(zhuǎn)流變儀 美國TA公司。

1.2 TGase酶催化大豆與小麥蛋白混合凝膠的制備

將蛋白乳狀液(11%,w/v,SPI∶WG=10∶1)用磁力攪拌器攪拌2 h后,邊攪拌邊加入TGase酶,分散均勻,用緩沖液調(diào)節(jié)pH,停止攪拌。將樣品放入振蕩的恒溫水浴鍋中,于一定溫度的水溶液中保溫2 h,再放于90 ℃恒溫水浴鍋高溫滅酶10 min,然后立即冰浴,樣品于4 ℃冰箱保存24 h。

1.3 各因素對混合蛋白凝膠特性的影響

1.3.1 TGase酶添加量對混合蛋白凝膠特性的影響 在TGase酶促大豆與小麥混合蛋白凝膠反應(yīng)體系中,控制蛋白濃度為11%(11 g/100 mL),反應(yīng)溫度40 ℃,反應(yīng)pH7.0,研究不同TGase酶添加量(0、10、20、30、40和50 U/g)對蛋白凝膠特性的影響。

1.3.2 反應(yīng)溫度對混合蛋白凝膠特性的影響 在TGase酶促大豆與小麥混合蛋白凝膠反應(yīng)體系中,控制蛋白濃度為11%(11 g/100 mL),TGase酶添加量為30 U/g,反應(yīng)pH7.0,研究不同反應(yīng)溫度(30、40、45、50、55和60 ℃)對蛋白凝膠特性的影響。

1.3.3 pH對混合蛋白凝膠特性的影響 在TGase酶促大豆與小麥混合蛋白凝膠反應(yīng)體系中,控制蛋白濃度為11%(11 g/100 mL),TGase酶添加量為30 U/g,反應(yīng)溫度40 ℃,研究不同反應(yīng)pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5)對蛋白凝膠特性的影響。

1.4 凍干小麥蛋白的制備

制備10% SPI,11% SPI和10% SPI+1% WG三種蛋白濃度的懸濁液,加入TGase酶形成凝膠。取凝膠樣品置于培養(yǎng)皿中于-20 ℃冰箱中冷凍,等凍結(jié)成塊放于冷凍干燥機中,取出磨成粉放置干燥器中備用。凍干的蛋白粉用來測定流變性、游離巰基含量、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)等性質(zhì)。

1.5 性質(zhì)的測定

1.5.1 凝膠強度的測定 依據(jù)Campbell等[9]測定方法,略有改動。采用TA-XT plus物性測定儀進行大豆與小麥混合凝膠的強度測定。測定方法是將制好的凝膠置于物性測定儀的載物臺上,然后使裝有P/0.5的平頭柱對準(zhǔn)燒杯中心壓縮兩次,即得到蛋白凝膠強度圖。測定參數(shù):探頭直徑:P/0.5;探頭測量前速度:5.0 mm/s;探頭測量時速度:5.0 mm/s;返回速度:5.0 mm/s;目標(biāo)深度:10 mm。第一次對凝膠按壓變形時所產(chǎn)生的最大破壞力作為凝膠強度。

1.5.2 凝膠持水性測定 依據(jù)Tang等[10]測定方法,略有改動。取5 g凝膠樣品置于離心管中,8000 r/min離心20 min,用濾紙小心吸除離心出來的水分,再次稱重。持水性(WHC)計算公式如下:

WHC(%)=[(Wt-Wr)/Wt]×100

式中,Wt為凝膠樣品中所含水分的總質(zhì)量(g);Wr為離心后凝膠溢出水分的質(zhì)量(g)。

1.5.3 凝膠溶解性的測定 依據(jù)Sun等[11]的測定方法,略有改動。將凝膠樣品配成濃度為10 mg/mL的水溶液,用磁力攪拌器攪拌均勻,8000 r/min離心20 min,上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,在595 nm吸光值下測定樣品吸光度。

1.5.4 凝膠流變性的測定 依據(jù)Sun等[6]測定方法,略有改動。將制備的凝膠進行振蕩溫度掃描分析,利用旋轉(zhuǎn)流變儀進行溫度掃描,測定參數(shù):將樣品放在測試平臺上,上板直徑為40 mm,狹縫為1 mm,溫度掃描設(shè)定參數(shù)為:頻率為0.1 Hz,應(yīng)變?yōu)?.01%,從25 ℃升溫至95 ℃,升溫速率為2 ℃/min,使用凡士林封口防止水分蒸發(fā)。記錄下彈性模量G′。

1.5.5 傅里葉變換紅外光譜分析 將冷凍干燥后的蛋白粉與適量溴化鉀混合均勻,干燥壓片,放在測試平臺上,用傅里葉變換紅外光譜儀掃描,測定波段為4000～400 cm-1,掃描次數(shù)為64次。用PeakFit v4.12軟件對酰胺I帶1600～1700 cm-1波段的圖譜進行分析。先校正基線,然后用Gaussian去卷積,再由俄二階導(dǎo)數(shù)擬合,多次擬合使殘差最小。根據(jù)峰面積計算各二級結(jié)構(gòu)的比率。各吸收峰與二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系:1610～1640 cm-1和1670～1690 cm-1為β-折疊;1640～1650 cm-1為無規(guī)則卷曲;1650～1660 cm-1為α-螺旋;1660～1670 cm-1和1690～1700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[8]。

1.5.6 凝膠游離巰基的測定 依據(jù)Hu等[12]測定方法,略有改動。配制pH=8.0的Tris-Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L Glycine和4 mmol/L Na2EDTA)和4 mg/mL DTNB溶液(Ellman試劑)。取樣品溶解在Tris-Gly緩沖液中配成0.5%的濃度,在25 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min,8000 r/min離心15 min,取3 mL上清液中加入0.03 mL DTNB溶液混合均勻,反應(yīng)15 min后在412 nm處測定吸光度,同時測定空白樣(以緩沖液代替樣品)。按如下公式計算:

SH(μmol/g)={[106/(1.36×104)]×A412×D}/C

式中,1.36×104是Ellman試劑的摩爾消光系數(shù);A412是412 nm處的吸光值;D為稀釋系數(shù);C為樣品最終濃度(mg/mL)。

1.5.7 掃描電鏡分析 依據(jù)Zhang等[13]測定方法,略有改動。取冷凍干燥后的樣品薄片,臨界點干燥,離子濺射,給樣品進行噴金處理。將樣品移至掃描電子顯微鏡臺面上,加速電壓20 kV,用掃描電鏡觀測并拍攝凍干樣品的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗進行3次重復(fù)平行,結(jié)果用平均值表示,采用Origin 9.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行擬合處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對TGase酶促蛋白凝膠的影響

2.1.1 TGase酶添加量對混合蛋白凝膠特性的影響 由圖1可知,隨著TGase酶添加量的增加,蛋白凝膠性能先增加后減小。當(dāng)TGase酶添加量為30 U/g蛋白時,凝膠強度達到最大值90.67 g,隨后凝膠強度開始下降。但持水性和溶解度在40 U/g蛋白時達到最大值,分別為78.26%和7.79 mg/mL。適量的酶添加量不僅可以縮短酶促反應(yīng)時間,提高反應(yīng)速度,而且可以避免由于加酶量過多造成浪費和成本的增加。所以選擇TGase酶添加量為30 U/g蛋白時,可得到較好性質(zhì)的蛋白凝膠。實驗表明,在確定的蛋白濃度下,TGase酶能提高大豆與小麥混合蛋白凝膠的凝膠強度和持水性。Zhang等[13]和Yang等[14]研究表明:TGase酶通過催化大豆和小麥蛋白中谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團與賴氨酸上的ε-氨基之間形成ε-(γ-glutamyl)lys共價鍵,這種共價鍵的連接力比氫鍵和二硫鍵更強,是它們的20倍,同時蛋白分子質(zhì)量增大,更加有利于發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成凝膠。

圖1 TGase酶添加量對混合蛋白凝膠特性的影響Fig.1 Effect of TGase addition amount on gel properties of TGase-induced protein gels

2.1.2 反應(yīng)溫度對混合蛋白凝膠特性的影響 由圖2可知,隨著反應(yīng)溫度的增加,蛋白凝膠性能先增加后減小。當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時,凝膠強度達到最大值87.67 g,隨后凝膠強度開始下降。持水性和溶解度也在40 ℃時達到最大值,分別為81.01%和7.83 mg/mL。有實驗表明,溫度對蛋白凝膠性質(zhì)的影響主要還是對其酶促反應(yīng)的影響,使TGase酶在最適溫度下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),進而引起蛋白凝膠性質(zhì)的變化[15]。郭秀瑾等[15]研究表明:微生物TGase酶的酶促反應(yīng)最佳溫度是40 ℃,最佳pH7.0。在最佳溫度下,酶促交聯(lián)反應(yīng)速度較快,使得蛋白質(zhì)表面的作用位點很快被交聯(lián),又增加了蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)的幾率,促進蛋白分子間形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),導(dǎo)致凝膠強度增加。所以選擇反應(yīng)溫度為40 ℃時,可得到較好性質(zhì)的蛋白凝膠。

圖2 反應(yīng)溫度對混合蛋白凝膠特性的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on gel properties of TGase-induced protein gels

2.1.3 pH對混合蛋白凝膠特性的影響 由圖3可知,隨著反應(yīng)pH的增加,蛋白凝膠性能先增加后減小。當(dāng)反應(yīng)pH為7時,凝膠強度達到最大值80.33 g,隨后凝膠強度開始下降。持水性和溶解度在pH為7時也達到最大值,分別為76.47%和7.46 mg/mL。實驗表明,反應(yīng)體系中pH的變化會影響蛋白質(zhì)分子的靜電荷量和離子化作用,影響蛋白質(zhì)相互作用體系中的疏水作用和靜電作用之間的平衡,進而影響凝膠的性質(zhì)和網(wǎng)狀性質(zhì)[5]。大豆蛋白和小麥蛋白的等電點分別為4.6和5左右,當(dāng)溶液為酸性狀態(tài)時,蛋白易結(jié)塊,分散性溶解度較低,不能與TGase酶接觸均勻,阻礙了蛋白分子間的交聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致蛋白凝膠不能形成較好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而降低了凝膠特性[16]。當(dāng)pH在中性狀態(tài)下,蛋白凝膠強度較大。當(dāng)pH大于8時,由于TGase酶發(fā)生空間構(gòu)象變化而部分失活,導(dǎo)致交聯(lián)反應(yīng)減少,蛋白凝膠強度下降。所以選擇pH為7時,可得到較好的蛋白凝膠。

圖3 pH對混合蛋白凝膠特性的影響Fig.3 Effect of pH on gel properties of TGase-induced protein gels

表1 小麥蛋白加入前后蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)及游離巰基的比較分析Table 1 Experimental analysis and results of WG addition amount on secondary structure and free sulfhydryl contents of TGase-induced protein gels

2.2 小麥蛋白的加入前后混合蛋白凝膠功能性質(zhì)的比較分析

小麥蛋白的加入前后混合蛋白凝膠的二級結(jié)構(gòu)、游離巰基含量、流變性、微觀結(jié)構(gòu)等功能性質(zhì)的變化規(guī)律如表1、圖4～圖6所示。

圖4 小麥蛋白加入前后蛋白凝膠的紅外光譜圖Fig.4 Effect of WG addition amount on FTIR spectra of TGase-induced protein gels

圖5 小麥蛋白加入前后蛋白凝膠流變性的比較分析(升溫溫度掃描)Fig.5 Effect of WG addition amount on rheological properties of TGase-induced protein gels(Heating phase)

圖6 小麥蛋白加入前后蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的比較分析Fig.6 Effect of WG addition amount on microstructure images of TGase-induced protein gels注:A、10% SPI;B、11% SPI;C、10% SPI+1% WG。

由表1、圖4～圖6可知,小麥蛋白的加入后,蛋白凝膠的二級結(jié)構(gòu)、游離巰基含量、流變性、微觀結(jié)構(gòu)等功能性質(zhì)均有顯著改善。由表1得到,蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)減少且伴隨著β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增加,原因是小麥蛋白加入后,使反應(yīng)體系中谷氨酰胺鍵含量上升,為TGase酶交聯(lián)作用提供更多作用位點,蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集形成緊密有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使得β-折疊含量升高,另外,TGase酶改性過程中,蛋白結(jié)構(gòu)展開導(dǎo)致氫鍵斷裂,使得α-螺旋含量降低。TGase酶的交聯(lián)改性使蛋白結(jié)構(gòu)更加緊密,阻止了多肽鏈的反轉(zhuǎn),從而降低了β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的減少[17]。與相同含量的未加小麥蛋白的凝膠對比,游離巰基含量明顯降低。原因在于TGase酶的交聯(lián)改性形成的聚集體使暴露在蛋白表面的游離巰基被包埋到分子內(nèi)部,另外,在改性過程中多肽鏈中含硫氨基酸通過氧化作用形成二硫鍵也會導(dǎo)致游離巰基含量的減少[18]。

彈性模量G′表示流體樣品的彈性,反應(yīng)出樣品的凝膠強度,由圖5得到,蛋白凝膠形成經(jīng)過兩次熱變性階段,在第一個峰值出現(xiàn)的階段,說明松散的凝膠結(jié)構(gòu)已初步形成,隨著溫度的進一步升高,導(dǎo)致半凝膠的流動性增加,導(dǎo)致剛形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞,凝膠強度降低,隨后G′隨著溫度的升高而升高,蛋白聚集體相互交聯(lián),形成不可逆的凝膠。結(jié)果顯示,小麥蛋白加入后,蛋白凝膠的凝膠強度(G′)顯著增強[17]。由圖6得到,隨著小麥蛋白的添加,蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)越來越致密和規(guī)則,主要是由于小麥蛋白的加入促進了TGase酶的交聯(lián)改性,使得蛋白舒展生成大量多聚體,從而形成更加穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)[19-20]。

3 結(jié)論

本文研究了TGase酶對大豆與小麥混合蛋白凝膠性質(zhì)的影響。通過TGase酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH3個因素對混合蛋白凝膠特性的影響研究可知:蛋白濃度為11%(11 g/100 mL)保持不變,TGase酶添加量為30 U/g,反應(yīng)溫度為40 ℃,反應(yīng)pH為7.0時,TGase酶對混合蛋白凝膠特性改善效果最強。小麥蛋白的加入前后混合蛋白凝膠功能性質(zhì)的比較分析結(jié)果顯示:小麥蛋白加入后,使反應(yīng)體系中谷氨酰胺鍵含量增加,為TGase酶交聯(lián)作用提供更多有效的作用位點,促進了蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集反應(yīng)。導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的β-折疊含量升高,游離巰基含量減少,凝膠彈性模量(G′)增強,形成了更為多空且緊密有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使得混合蛋白的凝膠性能顯著增強。本研究為拓寬大豆蛋白和小麥蛋白的綜合利用具有重要意義。

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Effect of wheat gluten on gelation properties of soy protein isolate induced by transglutaminase crosslinking

QIN Xin-sheng,JIANG Shao-tong,ZHAO Yan-yan,ZHENG Zhi*

(School of Food Science and Engineering,Hefei University of Technology,Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province,Hefei 230009,China)

To study the effect of transglutaminase(TGase)on gel properties of soy protein isolate(SPI)and wheat gluten(WG)mixtures,the change of functional properties of mixed protein gels were measured,and compared with basic SPI gels. The effects of TGase enzyme concentration,temperature,and pH on colloidal characteristics had been investigated. The optimum parameters were determined as follows:protein concentration 11 g/100 mL,TGase enzyme concentration 30 U/g，temperature 40 ℃ and pH7.0. Under these conditions,TGase had the highest improving effect on colloidal properties of mixed protein gels. Compared with TGase induced SPI gels,an increase in theβ-sheet content and gel strength(G′),and a reduction in free sulfhydryl content and resulted in denser and more homogeneous networks of the mixed protein gels.

soy protein isolate;wheat gluten;transglutaminase;gelation

2016-09-02

秦新生(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品資源綜合利用，E-mail:qinxinsheng@mail.hfut.edu.cn。

*通訊作者:鄭志(1971-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail:zhengzhi@hfut.edu.cn。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)課題(2013AA102201)；安徽省科技重大專項項目(16030701082)；安徽省科技攻關(guān)項目(1301031031、15czz03096)。

TS201.7

A

1002-0306(2017)08-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.033