復(fù)合中性蛋白酶水解乳清蛋白中β-乳球蛋白的工藝條件優(yōu)化

韓仁嬌,王彩云,羅述博,程 英,云戰(zhàn)友

(1.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110; 2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110)

復(fù)合中性蛋白酶水解乳清蛋白中β-乳球蛋白的工藝條件優(yōu)化

韓仁嬌1,2,王彩云1,2,羅述博1,2,程 英1,2,云戰(zhàn)友1,2

(1.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110; 2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110)

為優(yōu)化雙酶水解技術(shù)生產(chǎn)水解乳清蛋白工藝,探尋適度水解條件下最優(yōu)的β-乳球蛋白水解工藝,本研究以Neutral protease F(以下簡稱F酶)添加量、Neutral protease G酶(以下簡稱G酶)添加量、酶解溫度為主要影響因素,結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中的其他水解條件,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,探討F酶與G酶添加量、酶解溫度的最佳組合。結(jié)果表明:F酶與G酶同時(shí)添加,F酶添加量0.44%(相當(dāng)于2672.32 U/g)、G酶添加量0.08%(相當(dāng)于362.24 U/g)、酶解溫度55.2 ℃時(shí)生產(chǎn)乳清水解蛋白的β-乳球蛋白水解率高達(dá)58.99%±0.02%,與市售品牌水解乳清蛋白相比,過敏原β-乳球蛋白水解率最高,分子量分布在1000～180 u之間的肽段占51.76%,游離氨基酸含量為2.34%,明顯優(yōu)于市售同類產(chǎn)品。

乳清蛋白,復(fù)合中性蛋白酶,β-乳球蛋白水解率,分子質(zhì)量分布,響應(yīng)面法

乳清蛋白作為一種重要的乳源食品蛋白,經(jīng)過生物酶解可制備易于人體消化吸收的肽段[1-2],還能產(chǎn)生一些具有特殊生理功能的生物活性肽,如具有降血壓功能的降血壓肽、具有促進(jìn)鈣鐵吸收的酪蛋白磷酸肽,具有抗菌功能的抑菌肽等[3-5]。但是牛乳乳清蛋白中所含有的β-乳球蛋白(β-Lg),是導(dǎo)致嬰幼兒過敏的主要過敏原,人乳中并不含有這一蛋白組分,但它在牛乳乳清蛋白中所占的比例高達(dá)56%～60%[6-8],所以,要生產(chǎn)母乳化、舒適或是低致敏性的嬰幼兒配方奶粉,降低或去除乳清蛋白中的β-乳球蛋白是十分必要的。

生物酶解法是一種降低β-乳球蛋白含量的新手段,該方法工藝簡單、生產(chǎn)成本低,在水解β-乳球蛋白的同時(shí)可獲得大量的生物活性肽,提高乳清蛋白的生物效價(jià),拓寬乳清蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域。研究表明,在相同濃度以及相同氨基酸組成的條件下,人體對(duì)肽的吸收速度要比游離氨基酸快,尤其是小肽(二肽、三肽)[9-10]。但是,在水解乳清蛋白的過程中勢必會(huì)產(chǎn)生不同比例的游離氨基酸組分,而游離氨基酸含量過高食用后會(huì)導(dǎo)致嬰兒體內(nèi)滲透壓的升高,進(jìn)而產(chǎn)生不適感。因此,提高水解產(chǎn)物中小肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、降低或控制游離氨基酸比例,對(duì)制備優(yōu)質(zhì)的水解乳清蛋白是十分必要的。

本研究采用生物酶解技術(shù),使用前期篩選后獲得的兩種中性蛋白酶(Neutral protease F,F酶和Neutral protease G,G酶)復(fù)合酶解乳清蛋白,以β-乳球蛋白水解率為主要考察指標(biāo),對(duì)兩種蛋白酶的最適添加量和最適酶解溫度進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析,進(jìn)而獲得乳清蛋白達(dá)到適度水解(水解度在10%左右)狀態(tài)下的最佳水解工藝,對(duì)水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布和β-乳球蛋白水解率進(jìn)行了檢測,同時(shí)與市售同類產(chǎn)品進(jìn)行了β-乳球蛋白水解率和分子質(zhì)量分布情況的對(duì)比。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

Neutral protease F 酶活607345.5 U/g,市售商業(yè)蛋白酶;Neutral protease G 酶活452800 U/g,市售商業(yè)蛋白酶;濃縮乳清蛋白 WPC80蛋白質(zhì)含量80.2%,新西蘭恒天然公司;水解乳清蛋白1、2、3 為3種市售水解乳清蛋白粉;β-Lg(色譜純)、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Marker)、Tris-Base、細(xì)胞色素C(MW12384)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)等 均為分析純,Sigma公司。

T6紫外-可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ML1602型電子天平 梅特勒公司;LSHZ-300型冷凍水浴恒溫振蕩器 太倉培英;BUCHI B-370型凱氏定氮儀 瑞士BUCHI公司;1200高效液相色譜儀 安捷倫;iMark酶標(biāo)儀、Mini-PROTEAN垂直電泳儀 美國伯樂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白水解工藝 將WPC80與水按照1∶9的比例配制成蛋白溶液,按比例加入蛋白酶,在攪拌轉(zhuǎn)速為450 r/min的條件下進(jìn)行水解,該過程保持溫度恒定,水解2 h后加入1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.8～7.0,取出溶液置于85 ℃水浴中保溫10 min,冷卻至50 ℃后進(jìn)行噴霧干燥。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

1.2.2.1 F酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響 將WPC80與水按照1∶9的比例配制成蛋白溶液,在G酶添加量為底物蛋白添加量的0.08%的條件下,分別按[E]/[S]比例為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%加入蛋白酶F,該過程始終保持溫度為55 ℃,其他條件及操作按1.2.1,考察不同F(xiàn)酶添加比例對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響,確定最佳的F酶添加量。

1.2.2.2 G酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響 將WPC80與水按照1∶9的比例配制成蛋白溶液,在F酶添加量為底物蛋白添加量的0.4%的條件下,分別按[E]/[S]比例為0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.11%加入蛋白酶G,該過程始終保持溫度為55 ℃,其他條件及操作按1.2.1,考察不同G酶添加比例對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響,確定最佳的G酶添加量。

1.2.2.3 酶解溫度對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響 將WPC80與水按照1∶9的比例配制成蛋白溶液,按以上確定的最適F酶和G酶添加量分別為底物蛋白添加量的0.4%和0.07%的比例添加兩種蛋白酶,在攪拌轉(zhuǎn)速為450 r/min、水解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃的條件下進(jìn)行水解,其他條件及操作按1.2.1,考察不同酶解溫度對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響,確定最佳的酶解溫度。

1.2.3 F酶單獨(dú)酶解樣品的制備 將WPC80與水按照1∶9的比例配制成蛋白溶液,按[E]/[S]為0.4%的比例加入蛋白酶F,在攪拌轉(zhuǎn)速為450 r/min的條件下進(jìn)行水解,該過程保持溫度恒定55 ℃,水解2 h后加入1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.8～7.0,取出溶液置于85 ℃水浴中保溫10 min,冷卻至50 ℃后進(jìn)行噴霧干燥。

1.2.4 水解度測定 采用三硝基苯磺酸鈉(TNBS)法[11-12]。

1.2.5β-乳球蛋白水解率的測定 采用SDS-PAGE法測定[13],β-乳球蛋白水解率的計(jì)算公式如下:

β-乳球蛋白水解率(%)=(水解前β-乳球蛋白含量-水解后β-乳球蛋白含量)/水解前β-乳球蛋白含量×100。

1.2.6 分子質(zhì)量分布測定 采用高效液相色譜法測定,具體檢測條件如下。

色譜條件:色譜柱:TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm,流動(dòng)相:乙腈∶水∶三氟乙酸為45∶55∶0.1(V/V),在UV220 nm下檢測,流速為0.5 mL/min,柱溫為30 ℃。

樣品制備:將樣品配制成1 mg/mL的溶液,吸取2 mL于10 mL容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,用微孔過濾膜過濾后供進(jìn)樣。

相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線:以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lg Mr)對(duì)保留時(shí)間作圖得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程。

1.2.7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì),運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以β-乳球蛋白水解率為響應(yīng)值,選定F酶添加量、G酶添加量和酶解溫度,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),其中蛋白酶添加量以占蛋白干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì),實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert7.0軟件(Static Made Easy,Minneapolis,MN,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 F酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響 F酶與G酶同時(shí)添加,確定G酶添加量不變,改變F酶的添加量,考察其對(duì)β-乳球蛋白水解率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 F酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響Fig.1 Effect of F-protease concentration on β-Lg hydrolysis rate

由圖1可知,β-乳球蛋白水解率隨著F酶添加量的增加不斷上升,當(dāng)添加量超過底物蛋白的0.4%時(shí),β-乳球蛋白水解率上升趨緩；另外,當(dāng)F酶添加量低于底物蛋白的0.4%時(shí),隨著蛋白酶添加量的增加水解產(chǎn)物中分子量處于1000～180 u之間的肽段的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加；當(dāng)添加量超過底物蛋白的0.4%時(shí),水解產(chǎn)物游離氨基酸(分子量<180 u的組分)含量明顯增加；考慮到添加過多的蛋白酶對(duì)β-乳球蛋白水解率影響不大,反而使水解產(chǎn)物中產(chǎn)生較多的游離氨基酸組分,又增加生產(chǎn)成本,破壞水解產(chǎn)物的風(fēng)味,所以選擇F酶添加量為底物蛋白的0.4%左右較為合適。

2.1.2 G酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響 F酶與G酶同時(shí)添加,確定F酶添加量不變,考察在此基礎(chǔ)上G酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子量分布的影響,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知,β-乳球蛋白水解率隨著G酶添加量的增加呈增加趨勢,但變化幅度不明顯,但分子質(zhì)量分布受G酶添加量影響較明顯。隨著添加量的增加水解產(chǎn)物中處于1000～180 u之間的肽段比例逐漸增加,游離氨基酸組分逐漸減少,當(dāng)添加量超過0.07%時(shí),分子質(zhì)量變化趨勢趨緩,考慮到添加過多的G酶對(duì)β-乳球蛋白水解率和分子量分布影響不大,還會(huì)引起生產(chǎn)成本的提高,所以選擇G酶添加量為0.07%左右較為合適。

2.1.3 酶解溫度對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響 由圖3可知,在兩種蛋白酶同時(shí)水解且添加量不變的情況下,β-乳球蛋白水解率隨著酶解溫度的升高先升高后降低,當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí),β-乳球蛋白水解率達(dá)到最高值,當(dāng)酶解溫度達(dá)到60 ℃時(shí),有部分蛋白酶已經(jīng)失活,所以其β-乳球蛋白水解率明顯下降,綜合考慮β-乳球蛋白水解率和水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布,選擇酶解溫度為55 ℃左右較為合適。

圖3 酶解溫度對(duì)β-乳球蛋白水解率及分子質(zhì)量分布的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on β-Lg hydrolysis rate

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化水解乳清蛋白生產(chǎn)工藝

2.2.1 模型建立及顯著性分析 根據(jù)表1方案進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),在17個(gè)實(shí)驗(yàn)中,1～12是析因?qū)嶒?yàn),13～17是中心實(shí)驗(yàn),用來估算實(shí)驗(yàn)誤差。響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

經(jīng)回歸擬合后,實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示。

Y=58.75+1.39A+0.17B+0.33C+0.12AB-0.21AC+0.07BC-1.89A2-0.04B2-4.02C2

由表3可以看出,A、A2、C2為極顯著性影響因素,C和B2影響顯著。在各影響因素中,F酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率影響最大,其次是酶解溫度和G酶添加量。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 根據(jù)模型方程繪制β-乳球蛋白水解率響應(yīng)面圖,結(jié)果如圖4～圖6所示。從圖中可以直觀地看出各因素對(duì)β-乳球蛋白水解率的影響。

由圖4、圖5可以看出,當(dāng)G酶添加量和酶解溫度不變時(shí),β-乳球蛋白水解率隨F酶添加量的增加而升高,當(dāng)達(dá)到一定值以后略有降低;當(dāng)F酶添加量和酶解溫度不變時(shí),β-乳球蛋白含量隨G酶添加量的增加變化趨勢不大,說明G酶的加入對(duì)于β-乳球蛋白的水解效果影響不大。F酶添加量對(duì)β-乳球蛋白含量影響較G酶添加量顯著,表現(xiàn)為曲線變化趨勢較大。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖4 F酶添加量和G酶添加量對(duì)β-乳球蛋白水解率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot for the effect of cross-interaction between F-protease concentration and G-protease concentration on β-Lg hydrolysis rate

注:*表示差異顯著(p<0.05);**表示差異極顯著(p<0.01)。

圖5 F酶添加量和酶解溫度對(duì)β-乳球蛋白水解率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot for the effect of cross-interaction between F-protease concentration and hydrolysis temperature on β-Lg hydrolysis rate

圖6 G酶添加量和酶解溫度對(duì)β-乳球蛋白水解率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between G-protease concentration and hydrolysis temperature on β-Lg hydrolysis rate

由圖5、圖6可以看出,當(dāng)F酶和G酶添加量不變時(shí),β-乳球蛋白水解率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,說明當(dāng)酶解溫度超過蛋白酶的最適溫度以后,隨著酶活力的逐漸降低其水解底物蛋白中β-乳球蛋白的能力也逐漸下降。

通過對(duì)模型方程求導(dǎo)計(jì)算,得到β-乳球蛋白水解率最高的酶解工藝參數(shù)為F酶添加量0.44%(相當(dāng)于2672.32 U/g)、G酶添加量0.08%(相當(dāng)于362.24 U/g)、酶解溫度55.17 ℃,由模型方程預(yù)測得到此時(shí)的β-乳球蛋白水解率是59.04%。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果,以F酶添加量0.44%、G酶添加量0.08%、酶解溫度55.2 ℃酶解生產(chǎn)水解乳清蛋白,通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得水解乳清蛋白的β-乳球蛋白水解率為58.99%±0.02%,與模型方程預(yù)測值基本一致。

2.3 酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布情況

采用高效液相色譜法對(duì)以上工藝制備的水解乳清蛋白的分子質(zhì)量分布情況進(jìn)行了檢測,測定結(jié)果見圖7。

圖7 酶解產(chǎn)物高效液相檢測圖譜Fig.7 HPLC diagram of whey protein hydrolyzate 注:1為水解前樣品的HPLC譜圖,2為F酶酶解產(chǎn)物HPLC譜圖,3為F酶與G酶共同酶解后產(chǎn)物HPLC譜圖。

分子量范圍(u)水解前濃縮乳清蛋白(WPC80，%)F酶單獨(dú)酶解后(%)F酶與G酶共同酶解后(%)>1000055192888196110000～30008997615983000～200019095526402000～10001033126213911000～50027513671888500～18016325163288<180203654235

以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lg Mr)對(duì)保留時(shí)間作圖得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程:lg Mr=6.62-0.259T,所以出峰時(shí)間在14 min之前的為分子量分布在10000 u以上的片段,β-乳球蛋白的分子量為18.4 ku,主要分布在10000 u以上的組分中,通過圖7與表4分子量分布檢測結(jié)果可以看出,水解前濃縮乳清蛋白的HPLC譜圖共有7個(gè)峰,但是由于個(gè)別峰出現(xiàn)疊加,導(dǎo)致直觀很難辨別,通過譜圖可以看出水解前濃縮乳清蛋白以分子量分布在10000 u以上的組分占主要比例,單獨(dú)加入F酶時(shí),對(duì)10000 u以上的組分有明顯的水解效果,>10000 u以上的組分比例由55.19%下降到28.88%,F酶與G酶共同作用時(shí)底物蛋白中>10000 u的組分有更進(jìn)一步的水解,這說明F酶與G酶都具備水解底物蛋白大分子的作用,但是F酶的作用效果更加明顯,即F酶是導(dǎo)致β-乳球蛋白水解的主要因素;單獨(dú)加入F酶以后分子量<1000 u組分所占的比例較水解前增加了38.96%,而加入G酶后該比例僅在單獨(dú)加入F酶的基礎(chǔ)上提高了不到10%,這說明F酶的加入是提高小肽比例的決定性因素;添加G酶以后游離氨基酸組分(<180 u)的比例明顯降低,說明G酶除了能使原本大分子量的肽段進(jìn)一步水解成小肽以外,還能使部分游離氨基酸再度交聯(lián)形成小肽,這對(duì)平衡乳清水解蛋白產(chǎn)品攝入人體以后的滲透壓以及改善水解產(chǎn)物的風(fēng)味起到一定作用。

分析以上分子量變化的原因可能是由于F酶是內(nèi)肽酶,主要作用于肽鏈內(nèi)部,可以使大分子蛋白斷裂成分子量相對(duì)較少的片斷,加之其酶活力較G酶更高一些,所以其對(duì)β-乳球蛋白這樣的大分子片段的水解效果更強(qiáng);而G酶雖然也有內(nèi)肽酶的成分,但是其酶活力相對(duì)較低,所以對(duì)大分子肽片段的水解能力相對(duì)弱一些;至于G酶能使部分游離氨基酸再度交聯(lián)形成小肽的原因主要是受蛋白酶固有特性的影響,其深層次機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

2.4 水解產(chǎn)物的凝膠電泳分析

采用上述復(fù)合中性蛋白酶對(duì)濃縮乳清蛋白進(jìn)行水解,水解前后的SDS-PAGE電泳圖如圖8所示,WHP1、WHP2、WHP3是采用相同方法三次實(shí)驗(yàn)制備的水解產(chǎn)物,其水解度分別為9.75%、10.40%、9.53%。

圖8 濃縮乳清蛋白水解前后的電泳結(jié)果Fig.8 Electrophoresis results of whey protein concentrate before and after hydrolysis

表5 不同品牌乳清水解蛋白關(guān)鍵指標(biāo)比較Table 5 Comparison of key indicators among different brands of whey protein hydrolyzate

由圖8可以看出,經(jīng)過復(fù)合中性蛋白酶水解以后,10000 u以上的組分含量明顯降低,經(jīng)計(jì)算WHP1、WHP2、WHP3三個(gè)樣品的β-乳球蛋白水解率分別為60%、73%、55%,平均水解率為62.6%,說明當(dāng)水解產(chǎn)物的水解度控制在10%左右時(shí),采用上述優(yōu)化的復(fù)合中性蛋白酶酶解工藝對(duì)乳清蛋白中β-乳球蛋白具有較好的水解效果。

2.5 與市售同類產(chǎn)品關(guān)鍵指標(biāo)對(duì)比

按照上述確定的工藝制備乳清水解蛋白,并與三款市售同類競品進(jìn)行對(duì)比,主要對(duì)比指標(biāo)為水解度、β-乳球蛋白水解率、1000～180 u肽段比例和游離氨基酸(<180 u)比例,測定結(jié)果如表5所示。

從表5可以看出,在水解度相近的情況下,本研究使用的復(fù)合中性蛋白酶酶解工藝生產(chǎn)的乳清水解蛋白的β-乳球蛋白水解率最高,達(dá)到60%以上,與其他市售同類產(chǎn)品相比,酶解產(chǎn)物分子量分布在1000～180 u之間的肽段比例最大,而游離氨基酸組分(分子量<180 u)所占的比例明顯低于市售同類產(chǎn)品,這說明在適度水解條件下,由F酶和G酶組成的復(fù)合中性蛋白酶體系對(duì)底物乳清蛋白中β-乳球蛋白有較好的水解效果,同時(shí)可以有效控制水解產(chǎn)物中游離氨基酸的形成,采用該復(fù)合中性蛋白酶酶解工藝生產(chǎn)的乳清水解蛋白在抗原水解率和消化吸收率上更有優(yōu)勢。

3 結(jié)論

利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析,探討提高β-乳球蛋白水解率的最佳酶解工藝參數(shù),所建立的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蚍从稠憫?yīng)值的變化,對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合較好。優(yōu)化結(jié)果顯示,在F酶與G酶同時(shí)添加,F酶添加量0.44%、G酶添加量0.08%、酶解溫度55.2 ℃條件下生產(chǎn)的水解乳清蛋白β-乳球蛋白水解率為58.99%±0.02%。以此條件為基礎(chǔ)生產(chǎn)的水解乳清蛋白與市售三款同類產(chǎn)品相比較抗原β-乳球蛋白水解率最高,分子質(zhì)量處于1000～180 u的肽段所占比例明顯高于市售同類產(chǎn)品,且產(chǎn)品中游離氨基酸組分所占比例得到明顯的控制。按照生產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉對(duì)乳清水解蛋白的要求,在該條件下制備的水解乳清蛋白更適合添加到嬰幼兒配方奶粉中,同時(shí),本研究中確定的復(fù)合中性蛋白酶酶解工藝及研究思路為后續(xù)提高嬰幼兒配方粉母乳化和舒適化程度的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of compound neutral enzymatic hydrolysis ofβ-lactoglobulin in whey protein

HAN Ren-jiao1,2,WANG Cai-yun1,2,LUO Shu-bo1,2,CHENG Ying1,2,YUN Zhan-you1,2

(1.Inner Mongolia Research Center of Diary Technology Co.,Ltd.,Hohhot 010110,China; 2.Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.,Ltd.,Hohhot 010110,China)

The purpose was to optimize the production of hydrolyzed whey protein by double enzyme hydrolysis technology,and to explore the optimal process ofβ-lactoglobul hydrolysis under moderate hydrolysis conditions. The enzymatic hydrolysis of whey protein with F-Neutral protease and G-Neutral protease was optimized using a Box-Behnken design with response surface methodology. Theβ-lactoglobulin hydrolysis rate of whey protein hydrolysate was 58.99%±0.02% when the optimal hydrolysis conditions were established as follows:0.44%(equivalent to 2672.32 U/g)F-protease,0.08%(equivalent to 362.24 U/g)G-protease,and hydrolysis at 55.2 ℃,which represented a maximum value over that reported for commercial whey protein hydrolyzate. Mass fraction of molecular weight 1000～180 u was 51.76%,and the free amino acid was 2.34%,significantly lower than the market similar products.

whey protein;complex neutral protease;β-lactoglobulin hydrolysis rate;molecular weight distribution;response surface methodology

2016-10-14

韓仁嬌(1986-)，女，碩士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail:hanrenjiao@yili.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)08-0203-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.031