鎘對背角無齒蚌鰓和肝臟氧化損傷的影響

楊惠珍，劉娜，衛(wèi)曉溪，王蘭

（山西大學生命科學學院，太原 030006）

鎘對背角無齒蚌鰓和肝臟氧化損傷的影響

楊惠珍，劉娜，衛(wèi)曉溪，王蘭*

（山西大學生命科學學院，太原 030006）

為了探明鎘（Cd2+）對背角無齒蚌（Anodonta woodiana woodiana）鰓和肝臟的氧化損傷，根據(jù)Cd2+96 h的半致死濃度，設置了5個處理組（4.22、8.43、16.86、33.72、67.45 mg·L－1）和1個空白對照組，分別處理24、48、72、96 h，通過實驗測定其鰓與肝臟中過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）含量、抗超氧陰離子能力（Superoxide anion，O2－·）、抑制羥自由基能力（Hydroxyl radical，·OH）及總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T－AOC）。結果顯示，在同一時間，與對照組相比，背角無齒蚌鰓和肝臟中H2O2含量整體表現(xiàn)為極顯著性升高（P＜0.01）；鰓抑制·OH能力出現(xiàn)極顯著性降低（P＜0.01），肝臟抑制·OH無明顯變化；鰓和肝臟抗O2－·能力均呈極顯著性降低（P＜0.01）；鰓和肝臟T－AOC呈極顯著性升高（P＜0.01）。研究表明，肝臟作為背角無齒蚌的解毒器官，對外源Cd2+的污染較為敏感，可以作為水體中鎘污染監(jiān)測的靶器官；鰓和肝臟抗O2－·能力均呈降低趨勢，說明O2－·可能是鎘致使背角無齒蚌氧化損傷的首要因素，可以作為水體鎘污染監(jiān)測的生物指標。

背角無齒蚌；鰓；肝臟；氧化損傷；鎘

背角無齒蚌（Anodonta woodiana woodiana）棲息于淡水底泥中，行動緩慢，長期接受水體污染物的暴露，能較為準確地反映棲息地底泥與淡水的污染狀況，是一種理想的環(huán)境污染指示生物[1－3]?？茖W界將背角無齒蚌作為環(huán)境指示生物的研究主要集中于有機化合物對其生理生化等的毒性影響，如：Alves[4]發(fā)現(xiàn)除草劑－2，4－二氯苯氧乙酸可以在無齒蚌中蓄積，且可以影響其生長與發(fā)育；Xia等[5]研究了農(nóng)藥－氟蟲腈異構體在背角無齒蚌體內的代謝毒性（蓄積、轉化和清除）；Qu等[6]探討了2，4－二氯苯酚和五氯苯酚對背角無齒蚌含硒谷胱甘肽過氧化物酶的影響。但是，對重金屬鎘致使背角無齒蚌相關組織的損傷研究則相對甚少。

鎘（Cd2+）是一種銀白色有光澤的重金屬，其在鋅－鎘電池等工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛利用，產(chǎn)生的鎘廢棄物對生態(tài)環(huán)境造成的污染日趨嚴重[7]，且主要以水體鎘污染形式存在。研究表明，鎘可通過食物鏈在人體中富集，進而打破機體組織器官活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的平衡，引起細胞抗氧化系統(tǒng)受損，導致組織器官病變，從而引起慢性或長期不可逆的病理效應[8－9]，ROS的過量產(chǎn)生是鎘引起細胞氧化損傷、導致生物體肝臟病變[10－11]、產(chǎn)生毒性作用的主要原因之一。生物體中的ROS主要包括過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）、超氧陰離子（Superoxide anion，O2－·）和羥自由基（Hydroxyl radical，·OH）等物質[12－13]。那么，鎘對背角無齒蚌ROS系統(tǒng)是否會產(chǎn)生影響? ROS系統(tǒng)的變化對背角無齒蚌抗氧化系統(tǒng)將產(chǎn)生怎樣的影響?本文通過設置不同濃度Cd2+溶液，對背角無齒蚌分別處理24、48、72、96 h，測定背角無齒蚌鰓和肝臟中ROS的含量，同時對鰓和肝臟總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T－AOC）進行測定，探討Cd2+對背角無齒蚌鰓和肝臟的氧化損傷，旨在為水體Cd2+污染尋找靈敏的生物學監(jiān)測指標，并為Cd2+污染對水生動物的組織病理影響提供數(shù)據(jù)支撐與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

背角無齒蚌也稱河蚌，于2013年4月購自太原市五龍口水產(chǎn)批發(fā)市場，置水族缸（45 cm×35 cm×30 cm）中暫養(yǎng)兩周。養(yǎng)殖條件：自來水曝氣48 h，室溫15℃，pH 6.8，溶氧6 mg·L－1以上。

1.1.2 試劑

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）、氯化鈉（NaCl）均為分析純；H2O2含量、抗O2－·能力、抑制·OH能力、T－AOC及總蛋白（TP）測定試劑盒（帶標準：考馬斯亮藍法），均購自南京建成生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

根據(jù)Cd2+對河蚌96 h LC50：134.9 mg·L－1的急性毒性實驗，設計了5個Cd2+濃度處理組4.22、8.43、16.86、33.72、67.45 mg·L－1和1個空白對照組，每個濃度設3個平行組。分別處理24、48、72、96 h。將108只大小相近、體重相當?shù)幕铙w河蚌（平均質量49.5 g，平均體長7.46 cm，平均體高3.2 cm）分別置于18個處理缸中（50 cm×30 cm×20 cm），每缸6只。對照組加4 L曝氣48 h的自來水，處理組加4 L不同濃度Cd2+溶液，室溫15℃，pH 6.8，溶氧6 mg·L－1以上。實驗期間不喂食、不換水，實驗過程中未出現(xiàn)河蚌死亡現(xiàn)象。

1.2.2 樣品制備

在染毒24、48、72 h和96 h后，用雙蒸水洗凈河蚌表面殘留的Cd2+溶液，分別剖取約0.1 g的鰓和肝臟組織，迅速置于液氮中，于－80℃超低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

按照質量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，10 000 r·min－1離心10 min，取上清10%勻漿待測。

1.2.3 生化指標及其測定方法

H2O2含量、抑制·OH能力、抗O2－·能力和T－AOC的測定均依據(jù)試劑盒的說明操作。

1.2.4 蛋白含量測定

采用Bradford方法，用考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒測定，標準蛋白以試劑盒提供的蛋白為參照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結果利用SPSS（中文17.0）軟件分析處理，用平均值±標準誤（mean±S.E.）表示，用偏度系數(shù)和峰度系數(shù)檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性，對符合正太分布的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One－Way ANOVA），應用Dunnett法進行對照組與處理組的比較，以P＜0.05和P＜0.01作為差異顯著和極顯著的界值。

2 結果與分析

2.1 Cd2+對背角無齒蚌鰓H2O2含量、抑制·OH能力和抗O2－·能力的影響

觀察圖1（a）得知：在同一時間，與對照相比，背角無齒蚌鰓中H2O2含量呈極顯著升高（P＜0.01）。在24、48、72 h，不同濃度Cd2+處理組相比，隨著Cd2+濃度的增加，H2O2含量呈先升后降趨勢。在96 h，16.86 mg·L－1處理組，H2O2含量達到最大值（22.68±2.87 mmol·g－1prot），是對照組的3倍。在4.22 mg·L－1Cd2+處理組，隨著時間的延長，H2O2含量逐漸增加；在8.43 mg·L－1Cd2+處理組，隨著時間的延長，H2O2含量逐漸降低；在較高濃度Cd2+處理組（16.86、33.72、67.45 mg· L－1），隨著時間的延長，H2O2含量呈倒U型趨勢，在96 h，H2O2含量逐漸恢復到對照組水平。

由圖1（b）得出，在24、72、96 h，與對照組相比，鰓抑制·OH能力出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.01）。在48 h，與對照組相比，鰓抑制·OH能力無明顯變化（P＞0.05）。在24 h，33.72 mg·L－1濃度組，鰓組織抑制·OH能力達到最低（0.575±0.175 mmol·g－1prot）。在同一濃度Cd2+處理組，隨著時間的延長，鰓組織抑制·OH能力均呈先升高后降低的趨勢。

從圖1（c）可知：在同一時間，與對照組相比，背角無齒蚌鰓組織抗O2－·能力均呈極顯著（P＜0.01）降低趨勢。在同一Cd2+濃度處理組，隨著時間的延長，鰓組織抗O2－·的能力無顯著變化。

2.2 Cd2+對背角無齒蚌肝臟H2O2含量、抑制·OH能力和抗O2－·能力的影響

由圖2（a）得知，在同一時間，與對照相比，肝臟中H2O2含量整體呈極顯著升高（P＜0.01）。在24 h，不同濃度Cd2+處理組相比，肝臟中H2O2含量呈逐漸升高的趨勢；在48 h，4.22、8.43、16.86、33.72 mg·L－1Cd2+處理組，肝臟中H2O2含量呈逐漸減低趨勢，在67.45 mg·L－1濃度組肝臟中H2O2含量略微升高；在72 h，不同濃度Cd2+處理組相比，肝臟中H2O2含量呈先升高后降低的趨勢；在96 h，肝臟中H2O2含量呈逐漸降低趨勢。在4.22、8.43、16.86、33.72 mg·L－1Cd2+濃度處理組，隨著時間的延長，肝臟中H2O2含量呈先升高后降低的趨勢；在67.45 mg·L－1Cd2+濃度處理組，隨著時間的延長，肝臟中H2O2含量呈逐漸降低的趨勢，且在96 h，67.45 mg·L－1濃度組H2O2含量降至最低，表現(xiàn)出明顯的濃度－時間－效應關系。

依據(jù)圖2（b）得知，與對照組相比，同一時間不同濃度或者同一濃度不同時間，肝臟抑制·OH能力均無顯著變化。

觀察圖2（c）發(fā)現(xiàn)，在同一時間，與對照組相比，肝臟抗O2－·能力呈極顯著降低（P＜0.01）。在48 h，不同濃度Cd2+處理組相比，4.22、8.43、16.86 mg·L－1Cd2+處理組，肝臟抗O2－·能力呈逐漸升高趨勢，33.72、67.45 mg·L－1Cd2+處理組，肝臟抗O2－·能力呈現(xiàn)回落趨勢。在48 h，16.86 mg·L－1Cd2+處理組，肝臟抗O2－·能力達到最高（26.31±3.06 mmol·g－1prot）。

2.3 Cd2+對背角無齒蚌鰓和肝臟T－AOC的影響

圖1 Cd2+對背角無齒蚌鰓H2O2含量、抑制·OH能力和抗O2－·能力的影響Figure 1 Effects of Cd2+on H2O2contents,capacity of resisting hydroxyl radical and superoxide anion in gill of Anodonta woodiana woodiana

圖2 Cd2+對背角無齒蚌肝臟H2O2含量、抑制·OH能力和抗O2－·能力的影響Figure 2 Effects of Cd2+on H2O2contents,capacity of resisting hydroxyl radical and superoxide anion in liver of Anodonta woodiana woodiana

如圖3（a）所示，在24、72、96 h，與對照組相比，鰓T－AOC呈升高趨勢，且在72、96 h，除67.45 mg·L－1Cd2+處理組鰓T－AOC能力無變化外，其他Cd2+濃度處理組鰓T－AOC能力均出現(xiàn)極顯著性升高（P＜0.01）。在48 h，與對照組相比，鰓T－AOC無明顯變化，維持穩(wěn)定；在4.22、8.43、33.72、67.45 mg·L－1Cd2+濃度處理組，隨著時間的延長，鰓T－AOC能力呈先升高后降低的趨勢；在16.86 mg·L－1Cd2+濃度處理組，鰓T－AOC能力呈逐漸升高趨勢。

觀察圖3（b）發(fā)現(xiàn)，在同一時間，與對照組相比，肝臟T－AOC呈極顯著性升高趨勢（P＜0.01）。在72 h，不同濃度Cd2+處理組相比，肝臟T－AOC呈先升高后降低的趨勢。在4.22、8.43、16.86 mg·L－1Cd2+濃度處理組，隨著時間的增加，肝臟T－AOC能力呈先升高后降低的趨勢。

圖3 Cd2+對背角無齒蚌鰓和肝臟T－AOC的影響Figure 3 Effects of Cd2+on T－AOC in gill and liver of Anodonta woodiana woodiana

3 討論

正常生理條件下，組織細胞中H2O2、·OH和O2－·含量由機體抗氧化系統(tǒng)維持動態(tài)平衡狀態(tài)[14]。當機體受到外界因素的脅迫時，ROS含量失衡，機體抗氧化系統(tǒng)受損[15]。本實驗結果也證實，Cd2+可以導致背角無齒蚌鰓和肝臟中H2O2、·OH和O2－·含量的失衡。

鰓主要由鰓絲構成，水流經(jīng)過鰓絲可以進行氣體交換，其承擔蚌體的呼吸作用。本實驗結果得出，與對照組相比，鰓組織抗O2－·能力減弱，H2O2含量增加，抑制·OH能力減弱。這可能是因為Cd2+可以誘使鰓細胞發(fā)生單電子氧化還原反應而產(chǎn)生O2－·[16]，O2－·在活性升高的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）[17－19]催化作用下，大量生成H2O2且不能被及時清除，則通過Fenton反應轉化為具有較強氧化活性的·OH[15，20]，從而致使鰓抑制·OH能力減弱。這一結果證實了Cd2+可以致使背角無齒蚌鰓組織中ROS的含量增加，進而誘使鰓組織中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量增加，脂質發(fā)生過氧化損傷[22]，核溶解和吞噬細胞增多[21]。本研究中H2O2含量的增加與李靜等[23]研究鎘可以誘導長江華溪蟹（Sinopotamon yangtsekiense）鰓、肝、胰腺中H2O2含量增加的結果一致。

肝臟承擔蚌體的解毒作用，含有豐富的抗氧化物酶類[24]。實驗結果得出：在同一時間，與對照組相比，肝臟抗O2-·能力呈極顯著性降低，H2O2含量呈極顯著性升高，抑制·OH能力無顯著變化，說明Cd2+可以引起肝臟抗氧化系統(tǒng)受損，迫使組織抗氧化能力下降[25-26]，在24 h，肝臟中H2O2含量呈逐漸升高的趨勢。這可能是因為肝臟中O2-·在活性升高的SOD[14]催化作用下，大量生成H2O2[15]，說明肝臟對鎘引起的毒性效應較為敏感，可以作為環(huán)境監(jiān)測的靶器官。然而，在48、72、96 h，不同濃度Cd2+處理組相比，肝臟中H2O2卻呈逐漸降低趨勢，這可能是因為：①肝臟中部分O2-·被細胞色素C直接催化形成水[27]，使生成的H2O2含量減少；②肝臟激活了過氧化物歧化酶（Catalase,CAT）[21]，其催化H2O2轉變?yōu)樗脱鯕鈁28]，致使肝臟中H2O2含量減少；③肝臟中生成的H2O2被細胞色素C釋放的電子還原，清除了部分H2O2[27]。肝臟抑制·OH能力無明顯變化，可能是因為肝臟產(chǎn)生的O2-·和H2O2被肝臟中抗氧化酶類（SOD、CAT等）代謝，很少或沒有O2-·和H2O2經(jīng)Fenton反應生成·OH，說明肝臟作為機體解毒器官，對外來毒物引起的氧化損傷具有一定抵御作用。鰓和肝臟中抗O2-·的能力均呈下降趨勢，說明O2-·可以作為監(jiān)測水生生態(tài)環(huán)境Cd2+污染的生物學指標。

T-AOC是機體中包括抗氧化酶系統(tǒng)及非酶系統(tǒng)相互作用的綜合性衡量指標。近年來，對T-AOC在水生態(tài)毒理學機制研究中受到了廣泛的重視，而且，認定組織中T-AOC是反映機體抗氧化作用的重要指標之一[29-30]。本研究結果顯示，在同一時間，與對照組相比，鰓和肝臟中T-AOC均呈升高趨勢，可能是因為鰓和肝臟ROS的生成刺激組織抗氧化防御系統(tǒng)活性增高，從而抵御活性氧對組織的損害[28]。但是，在4.22、8.43、33.72、67.45 mg·L-1Cd2+濃度處理組，隨著時間的延長，鰓T-AOC能力呈先升高后降低的趨勢；同時，在4.22、8.43、16.86 mg·L-1Cd2+濃度處理組，隨著時間的增加，肝臟T-AOC能力也呈先升高后降低的趨勢。這可能是因為：短時間Cd2+溶液處理背角無齒蚌，鰓和肝臟產(chǎn)生氧化應激反應，啟動組織的酶與非酶系統(tǒng)抵御ROS的氧化損傷，隨著時間的延長，鰓和肝臟中ROS產(chǎn)生過快或者過量[28]，SOD和GSH等抗氧化酶與非酶物質受損，鰓和肝臟細胞受損，T-AOC也呈降低趨勢，嚴重時將引發(fā)細胞凋亡[30-31]。

4 結論

（1）肝臟作為背角無齒蚌的解毒器官，對外源Cd2+污染較為敏感，其可以作為水體Cd2+污染監(jiān)測的靶器官。

（2）鰓和肝臟抗O2-·能力均呈降低趨勢，說明O2-·可能是Cd2+致使背角無齒蚌氧化損傷的首要因素，其可以作為水體Cd2+污染監(jiān)測的生物指標。

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Oxidative damage of cadmium on liver and gill of freshwater mussel Anodonta woodiana woodiana

YANG Hui－zhen,LIU Na,WEI Xiao－xi,WANG Lan*
（School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China）

In order to determine the oxidative damage in liver and gill of Anodonta woodiana woodiana by cadmium（Cd2+）,this study designed five different concentration treatment groups which were 4.22,8.43,16.86,33.72,67.45 mg·L－1,according to the medial lethal concentration of Cd2+,as well as one control group.It were measured and analyzed of the contents of hydrogen peroxide,resistant ability of superoxide anion and hydroxyl radical in the gill and liver during 24,48,72 and 96 h.Furthermore,the capacity of total antioxidant of gill and liver were also monitored.The results showed that the contents of hydrogen peroxide increased significantly compared with the control group in the gill and liver,while the ability of resisting superoxide anion was decreased significantly（P＜0.01）.For inhibiting the hydroxyl radial, the liver and gill indicated different results,which showed that the gill had the notable lower ability while there was no significant difference found in liver.The findings of the experiments showed that liver was more sensitive to Cd2+toxicity and liver could be as the target organ inAnodonta woodiana woodianathat could be used as the indicator organ for the water contamination.Moreover,the results indicated that the superoxide anion maybe the crucial factor for the oxidative damage of cadmium,so,it could be used as the biomarker for the cadmium contamination of freshwater.

Anodonta woodiana woodiana;gill;liver;oxidative damage;cadmium

X503.225

A

1672－2043（2017）04－0651－06

10.11654/jaes.2016－1291

2016－10－10

楊惠珍（1987—），女，山西盂縣人，博士，主要從事動物水環(huán)境毒理學研究。E－mail：751442077@qq.com

*通信作者：王蘭E－mail：lanwang@sxu.edu.cn

高等學校博導類基金項目（20111401110010）；山西省普通高校特色重點學科建設項目（2011－SXDX－SWX－003）

Project supported：Institutions of Higher University Research Funds（20111401110010）；Project of Shanxi Province Ordinary University Characteristic Key Discipline Construction（2011－SXDX－SWX－003）

楊惠珍，劉娜，衛(wèi)曉溪，等.鎘對背角無齒蚌鰓和肝臟氧化損傷的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36（4）：651－656.

YANG Hui－zhen,LIU Na,WEI Xiao－xi,et al.Oxidative damage of cadmium on liver and gill of freshwater mussel Anodonta woodiana woodiana[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（4）:651－656.