不同來源沙門氏菌的毒力基因檢測與耐藥性分析

宋 雪，趙 格，劉文化，孫婷婷，王 娟，趙建梅，洪 軍，李月華，黃秀梅，劉 娜，張林波，王君瑋

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（青島），山東青島 266032；3. 山東省郯城縣畜牧局，山東郯城 276100）

不同來源沙門氏菌的毒力基因檢測與耐藥性分析

宋 雪1，2，趙 格2，劉文化3，孫婷婷2，王 娟2，趙建梅2，洪 軍2，李月華2，黃秀梅2，劉 娜2，張林波1，王君瑋2

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（青島），山東青島 266032；3. 山東省郯城縣畜牧局，山東郯城 276100）

[目的]了解不同畜禽中沙門氏菌的攜帶狀況及其毒力和耐藥性，為動物源沙門氏菌的流行病學分析和防控提供數(shù)據(jù)和依據(jù)。[方法]從山東、吉林、江西、新疆和云南等地區(qū)采集樣本，用國標法分離鑒定沙門氏菌，用沙門氏菌血清型試劑盒檢測血清型，用PCR方法檢測毒力基因，最后用微量肉湯稀釋法（MIC）對分離菌株進行耐藥性分析。[結(jié)果]健康畜禽和發(fā)病畜禽樣本中的沙門氏菌分離率分別為20.67%（141/682）、6.13%（45/734）。發(fā)現(xiàn)4種沙門氏菌優(yōu)勢血清型，分別為德爾卑（42.6%）、印第安納（26.2%）、腸炎（17.7%）和湯普森（17%）。對分離菌株進行毒力基因分析，檢測SPI-1～SPI-5上的5個核心蛋白基因和spvA、B、C、D和R毒力質(zhì)?；?，其中健康畜禽樣本中沙門氏菌毒力島上的基因攜帶率與發(fā)病畜禽樣本中的攜帶率基本一致，但發(fā)病畜禽中的菌株毒力質(zhì)?；驍y帶率明顯高于健康畜禽。耐藥性檢測結(jié)果表明，除多西環(huán)素和慶大霉素外，發(fā)病動物中的沙門氏菌對抗生素的耐藥率均比健康動物中的高。豬源與雞源沙門氏菌對慶大霉素、頭孢噻呋、氧氟沙星、粘桿菌素的耐藥率差異顯著，對其他抗菌藥物略有差異，但不顯著。健康畜禽中的多數(shù)沙門氏菌株耐藥1～2種，占分離菌株總數(shù)的55.32%；發(fā)病畜禽中耐藥10種以上的沙門氏菌占分離株總數(shù)的44.44%。[結(jié)論]發(fā)病畜禽中的沙門氏菌分離率比健康畜禽中的低，但其毒力質(zhì)?；虻臄y帶率較健康畜禽中的高，且耐藥情況較嚴重，多重耐藥率高。該分析結(jié)果可為沙門氏菌的危害評估和防控措施制定提供依據(jù)。

健康畜禽；發(fā)病畜禽；沙門氏菌；毒力；耐藥性

沙門氏菌（Salmonella spp）是腸桿菌科的重要菌屬，也是能夠引發(fā)食物中毒的重要食源性病原菌[1]。沙門氏菌在自然界中分布廣泛，血清型眾多。在目前已發(fā)現(xiàn)的2 500多種血清型中，有20多種可以引起人獸共患病，其中危害較大的有鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、豬霍亂沙門菌等，而德爾卑沙門菌、湯卜遜沙門菌也可引起一些食源性疾病[2]。在我國，70%～80%的由致病菌引起的食物中毒事件是由沙門氏菌引起的[3]。全球每年約有9 380萬胃腸炎病例為沙門氏菌感染所致[4]?？杀簧抽T氏菌污染的食品種類比較廣泛，其中肉類食品最為常見。沙門氏菌毒力的強弱與其攜帶的毒力基因有關(guān)，大量不同的毒力因子相互作用、相互影響可以產(chǎn)生毒性。沙門氏菌毒力因子包括菌毛、腸毒素、毒力島、毒力質(zhì)粒等[5]。相同毒力基因?qū)Σ煌瑏碓瓷抽T氏菌致病性的影響不同，不同血清型沙門氏菌攜帶的毒力基因也不相同，菌株耐藥性增強也會導(dǎo)致其毒力增加[6]。

養(yǎng)殖過程中，沙門氏菌的原發(fā)感染或繼發(fā)感染，均可引起畜禽發(fā)病。目前，關(guān)于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中的發(fā)病畜禽和進入屠宰環(huán)節(jié)的健康畜禽中的沙門氏菌分離率和病原性狀相關(guān)性，尚未有報道。為探明兩種不同來源的沙門氏菌流行狀況，對不同來源沙門氏菌追本溯源，本研究選取養(yǎng)殖過程中的發(fā)病畜禽和屠宰過程中的健康畜禽為樣本，研究了沙門氏菌的攜帶率、血清型、毒力基因和耐藥性，并分析了其差異和相關(guān)性，補充了動物源性沙門氏菌的流行病學數(shù)據(jù)，同時也為不同來源沙門氏菌感染的有效防控和風險評估提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。IIA2型生物安全柜（萬心順昌）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海愛朗）、快速渦勻儀（深圳天南海北）、PCR儀（BIO-RAD）、電泳儀（北京六一儀器廠）、Gel Doc XR凝膠成像分析儀（BIO-RAD）、Luminex 200液相芯片分析儀（Luminex公司）。

1.1.2 主要試劑。緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）、亞曬酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、典液和0.1%煌綠溶液，均購于北京陸橋技術(shù)有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，購于賽博生物技術(shù)股份有限公司；DNA Marker DL 2000、GoTaq?Green Master Mix，購于TaKaRa公司；沙門氏菌血清型快速分型試劑盒，購于美國Luminex公司；革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板，購自上海星佰生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集。2016年從山東、吉林、江西、新疆和云南等地區(qū)采集1 425份健康畜禽和發(fā)病畜禽樣本（表1）。

表1 樣本采集具體信息（單位：份）

1.2.2 沙門氏菌的分離鑒定。按照國家標準《食品微生物學檢驗》（GB4789.4—2010）進行分離鑒定。將樣本接入BPW預(yù)增菌液中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h。然后，取200 μL預(yù)增菌液加入TTB和SC增菌液中，并分別置于42 ℃、37 ℃培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)蘸取2種增菌液分別接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑選紫色的可疑單菌落，再次接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中進行純化；挑選紫色的可疑單菌落，接種于大豆棟瓊脂培養(yǎng)板上，用水煮法提取可疑菌落的DNA備用。設(shè)計沙門氏菌保守基因invA[7]引物序列，以可疑菌落DNA為模板，利用PCR方法，對篩選出的可疑菌落進行基因水平鑒定，檢測菌株中是否含有目的基因片段。根據(jù)NCBI中已發(fā)表的沙門氏菌invA基因序列，設(shè)計引物：FinvA：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′；RinvA：5′-TCTCGCACCGTCAAAGGAACC-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL，30個循環(huán)，Go Taq?Greeen Master 12.5 μL；上下游引物各0.5 μL；DNA模板2 μL；Nuclease-Free Water 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；64 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃后延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在284 bp位置有明顯條帶的細菌為沙門氏菌。

1.2.3 沙門氏菌血清型鑒定。利用沙門氏菌血清型快速分型試劑盒和Luminex 200液相芯片分析儀，對菌株進行血清型鑒定。PCR反應(yīng)體系為25 μL，30個循環(huán)，Qiagen Hotstar Taq Master Mix 12.5 μL，滅菌去離子水8 μL，引物2.5 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性30 s，48 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。交聯(lián)沙門氏菌各抗原基因微球稀釋3.7倍，加入稀釋后微球45 μL和PCR產(chǎn)物5 μL，在95 ℃下反應(yīng)5 min，52 ℃反應(yīng)30 min，52 ℃保存?zhèn)溆?。在Luminex 200液相芯片分析儀中讀取數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。

1.2.4 沙門氏菌毒力基因檢測。根據(jù)國內(nèi)外對沙門氏菌毒力因子的研究結(jié)果，在GenBank中查找10對影響沙門氏菌毒力的基因，參照文獻[8-11]設(shè)計引物（表2），對分離得到的沙門氏菌進行毒力基因檢測。

表2 PCR擴增引物

1.2.5 沙門氏菌耐藥性檢測。利用微量肉湯稀釋法（MIC），測定沙門氏菌對13種抗感染藥的敏感性。每塊藥敏板上，對每種抗生素設(shè)有一系列對倍稀釋濃度的抗生素試劑，通過加入待檢細菌與肉湯培養(yǎng)液稀釋的菌懸液，經(jīng)18～20 h孵育后，對藥敏板條進行判讀，經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到MIC值，并根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）的相應(yīng)標準，獲得相應(yīng)的敏感、中度敏感和耐藥結(jié)果。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析。利用SPSS軟件，分析血清型、毒力基因和耐藥性檢測結(jié)果。通過卡方檢驗，分析健康畜禽和發(fā)病畜禽樣本中的沙門氏菌在優(yōu)勢血清型、毒力基因、耐藥性和多重耐藥性等方面的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源沙門氏菌的分離率

樣品經(jīng)沙門氏菌顯色、培養(yǎng)基培養(yǎng)和PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)陽性菌株在284 bp處有明顯的目的條帶。健康畜禽與發(fā)病畜禽中沙門氏菌的分離結(jié)果見表3，鑒定結(jié)果見圖1。

表3 沙門氏菌分離率（單位：%）

圖1 部分沙門氏菌分離株invA基因PCR鑒定結(jié)果

2.2 沙門氏菌血清型分析

對不同來源沙門氏菌，經(jīng)沙門氏菌血清型試劑盒分析后，共得到12種血清型（表4）。其中前4種優(yōu)勢血清型依次為德爾卑沙門氏菌（S.Derby）、印第安納沙門氏菌（S.Indiana）、腸炎沙門氏菌（S.Enteritidis）和湯普森沙門氏菌（S.Thompson）。經(jīng)SPSS軟件計算，不同來源的沙門氏菌優(yōu)勢血清型差異不顯著，P值均大于0.05（圖2、圖3）。

表4 沙門氏菌分離株血清型（單位：株）

圖2 健康畜禽和發(fā)病畜禽中沙門氏菌4種優(yōu)勢血清型對比

圖3 豬源與雞源沙門氏菌4種優(yōu)勢血清型對比

2.3 沙門氏菌毒力基因檢測

對分離到的沙門氏菌進行毒力基因檢測，發(fā)現(xiàn)健康畜禽中沙門氏菌毒力島上的基因攜帶率與發(fā)病畜禽中的基因攜帶率基本一致，除SPI-2毒力島上的sseL基因外，其他基因攜帶率均在90%以上。健康畜禽中沙門氏菌毒力質(zhì)粒上的基因攜帶率均在40%以下，而發(fā)病畜禽中的基因攜帶率均在50%以上（表5、圖4—圖6）。

2.4 沙門氏菌耐藥性分析健康畜禽和發(fā)病畜禽中的沙門氏菌耐藥性檢測結(jié)果見表6，對不同來源樣本的分析結(jié)果見圖7。對健康畜禽與發(fā)病畜禽中的沙門氏菌進行耐藥性對比，發(fā)現(xiàn)除多西環(huán)素和慶大霉素外，發(fā)病動物中的沙門氏菌對抗生素的耐藥率均比健康動物中的高。對不同宿主來源的沙門氏菌進行耐藥性分析，結(jié)果見圖8。經(jīng)SPSS軟件分析發(fā)現(xiàn)，豬源與雞源沙門氏菌對慶大霉素、頭孢噻呋、氧氟沙星、粘桿菌素的耐藥率差異顯著，對其他抗菌藥物不顯著。健康畜禽與發(fā)病畜禽中的沙門氏菌多重耐藥結(jié)果見表7、圖9。健康畜禽中分離的耐藥1～2種的沙門氏菌數(shù)量最多，占分離菌株總數(shù)的55.32%。發(fā)病畜禽中分離的耐藥10種以上的沙門氏菌數(shù)量最多，占分離株總數(shù)的44.44%。

表5 沙門氏菌分離株毒力基因的攜帶（單位：株）

圖4 沙門氏菌分離株毒力基因的PCR擴增

圖5 健康畜禽與發(fā)病畜禽沙門氏菌分離株毒力基因攜帶率對比

圖6 豬源與雞源沙門氏菌分離株毒力基因攜帶率對比

圖7 健康畜禽與發(fā)病畜禽沙門氏菌分離株耐藥率對比結(jié)果

表6 沙門氏菌耐藥性檢出結(jié)果統(tǒng)計（單位：株）

圖8 豬源與雞源沙門氏菌分離株耐藥率對比結(jié)果

表7 耐藥種數(shù)與耐藥菌數(shù)（單位：株）

圖9 沙門氏菌分離株多重耐藥率對比結(jié)果

3 討論

本研究對健康畜禽和發(fā)病畜禽中的沙門氏菌進行了分離鑒定以及血清型、毒力基因與耐藥性檢測。經(jīng)綜合考慮，在全國范圍內(nèi)，選取了5個地區(qū)，采集發(fā)病、健康2種來源以及豬源和雞源2種宿主的樣本。雖然樣本量大體一致，但是從不同地區(qū)分離到的菌株數(shù)差異較大，不符合統(tǒng)計學意義上的正態(tài)分布規(guī)律，所以未對不同地區(qū)沙門氏菌的差異進行分析。實驗結(jié)果表明，從不同樣本來源角度分析，健康畜禽中沙門氏菌的分離率為20.67%，發(fā)病畜禽中的為6.13%。從不同宿主來源角度分析，豬源沙門氏菌分離率為12.86%，雞源為13.42%，與劉鮮鮮等[12-13]對山東、南寧生豬屠宰加工環(huán)節(jié)沙門氏菌分離率（18.8%、32.67%）以及朱冬梅[14]對四川肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)沙門氏菌分離率（11.56%）相吻合。發(fā)病畜禽中的沙門氏菌分離率為6.13%，與王菊梅等對新疆部分地區(qū)病死雞源沙門氏菌分離率（4.5%）較一致。

從不同樣本來源角度分析，健康畜禽和發(fā)病畜禽中沙門氏菌的血清型差異性不顯著，優(yōu)勢血清型一致，均是德爾卑沙門氏菌（S.Derby）、印第安沙門氏菌（S.Indiana）、腸炎沙門氏菌（S.Enteritidis）和湯普森沙門氏菌（S.Thompson）。從不同宿主來源角度分析，豬源鼠傷寒沙門氏菌分離率比雞源高，而雞源腸炎沙門氏菌分離率比豬源高。陳玲等[15]鑒定南方食品中污染的沙門氏菌血清型為德爾卑沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。侯曉剛等[16]在四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中檢出11種沙門氏菌血清型，其中德爾卑（S.Derby）、鼠傷寒（S.Typhimurium）、波茨坦（S.Potsdam）、吉韋（S.Give）沙門氏菌為優(yōu)勢血清型。王嘉煒[17]對楊凌及周邊城市雞源沙門氏菌血清型進行檢測，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌（S.Typhimurium）、湯普森沙門氏菌（S.Thompson）、埃森沙門氏菌（S.Essen）和嬰兒沙門氏菌（S.Infant）等血清型比較常見。這都說明沙門氏菌血清型具有地域和宿主差異性，而發(fā)病與否并不是引發(fā)沙門氏菌血清型差異的主要因素。但也有一些血清型的感染與宿主相關(guān)，不同血清型沙門氏菌有不同的宿主范圍。

對分離到的沙門氏菌進行毒力基因檢測，從不同樣本來源角度分析發(fā)現(xiàn)，健康畜禽、發(fā)病畜禽中的沙門氏菌對毒力島上的基因攜帶率基本一致。除毒力島SPI-2基因攜帶率較低外，其他毒力島基因攜帶率均在90%以上。健康畜禽、發(fā)病畜禽中的沙門氏菌毒力質(zhì)粒基因的攜帶率差異較大，發(fā)病畜禽中的沙門氏菌毒力質(zhì)?；虻臄y帶率普遍偏高于健康畜禽中的，可見沙門氏菌更容易通過獲得毒力質(zhì)粒產(chǎn)生更強的毒性。從不同宿主來源角度分析，豬源SPI-2的sseL基因攜帶率比雞源高，而雞源毒力質(zhì)?；驍y帶率比豬源高。研究證明，不同的SPI-2堿基組成和基因分布可以驅(qū)動沙門氏菌的毒力變化，SPI-2中的基因突變可大大改變沙門氏菌對宿主的選擇和在不同宿主中的毒性。

對分離到的細菌進行耐藥性檢測，從不同樣本來源角度分析發(fā)現(xiàn)，除多西環(huán)素和慶大霉素外，發(fā)病動物中的沙門氏菌對抗生素的耐藥率均高于健康動物中的。從不同宿主來源角度分析發(fā)現(xiàn)，豬源與雞源沙門氏菌對慶大霉素、頭孢噻呋、氧氟沙星、粘桿菌素的耐藥率差異顯著。這與沈海燕等[18]、樂其新等[19]、王曉泉等[20]分別對上海市、江蘇省、合肥市畜禽產(chǎn)品中分離的沙門氏菌耐藥性檢測結(jié)果相吻合，說明對發(fā)病動物在其發(fā)病期間使用了大量抗生素，從而使沙門氏菌產(chǎn)生了較高耐藥性。因此，在飼養(yǎng)、預(yù)防和臨床治療上，對豬源和雞源沙門氏菌的用藥要有一定的差異。

沙門氏菌感染目前仍然是全世界令人憂慮的公共健康問題。沙門氏菌株的遺傳組成允許其在各種環(huán)境中存在，包括人、動物和非動物宿主，這增加了消除沙門氏菌污染的難度。本研究通過對不同樣本來源、不同宿主來源的沙門氏菌進行分離鑒定及血清型、毒力基因和耐藥性分析，揭示了沙門氏菌在不同樣本來源、不同宿主之間的分布狀況、流行病學特征，并對不同來源菌株進行了追本溯源，為預(yù)警和控制沙門氏菌病暴發(fā)提供了依據(jù)。

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（責任編輯：朱迪國）

Comparative Analysis of Virulent Genes and Drug Resistance of Salmonella Isolated from Different Sources

Song Xue1，2，Zhao Ge2，Liu Wenhua3，Sun Tingting2，Wang Juan2，Zhao Jianmei2，Hong Jun2，Li Yuehua2，Huang Xiumei2，Liu Na2，Zhang Linbo1，Wang Junwei2
（1. College of Life Science，Jilin Agricultural University，Chanchun，Jilin 130118；2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Livestock and Poultry products（Qingdao）of Ministry of Agriculture，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；3. Tancheng Animal Husbandry Bureau，Tancheng，Shandong 276100）

[Objective] In order to recognize the carrying situation ofSalmonellain different livestock and poultry and analyze the virulence and drug resistance，so as to provide data and basis for its epidemiological analysis and prevention and control. [Methods] Samples collected from Shandong，Jilin，Jiangxi，Xinjiang，Yunnan were conductedSalmonellaisolation and identification by the national method. Then these isolated strains were detectedserotypes and virulent genes using related kits and PCR method respectively. Finally，drug resistance analysis was made through broth microdilution method（MIC）. [Results] The isolation rate ofSalmonellafrom healthy animals was 21.63%（141/652），while that in diseased animals was 13.64%（45/330）. There were 4 dominant serotypes consisting ofS.derby（42.6%），S.indian（26.2%），S.enteritidis（17.7%），andS.thompson（17%）. Virulent gene analysis was conducted by detecting the 5 core protein genes of SPI-1～SPI-5，as well as the virulent plasmid genes of spvA、B、C、D and R. Results showed the carrying of virulent genes existing inSalmonellapathogenicity island was basically identical between the healthy and diseased animals，while the virulent genes carried by plasmids were signifi cantly higher in diseased animals. According to the drug resistance test，a higher resistance rate was observed in diseased animals than in the healthy animals，except against Doxycycline and Gentamicin. Beside，Salmonellastrains isolated from chicken and swine showed obviously differences in drug resistance against Gentamicin，Cefurofen，Ofl oxacin and Colchicine. As for other antimicrobial agents，little difference was got. Most of the strains isolated from healthy livestock and poultry were resistant to 1～2 antibiotics，accounting for 55.32% of the total strains. On the other side，Salmonellastrains derived from diseased animals which revealed resistance to more than 10 antibiotics took up a proportion of 44.44%. [Conclusion] The isolation rate ofSalmonellain diseased animals was lower than that in healthy ones，however the virulent genes carried by plasmids in diseased animals was higher，showing severe and multiple drug resistance. This study would offer a basis forSalmonellarisk assessment and the establishment of corresponding prevention and control measures.

diseased animal；healthy animal；Salmonella；virulence；drug resistance

S852.61

：A

：1005-944X（2017）05-0040-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.05.011

農(nóng)業(yè)部國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估重大專項（GJFP2016007）；留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目

王君瑋、張林波