2014—2015年新疆家養(yǎng)動物小反芻獸疫病原學(xué)監(jiān)測

（新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830063）

2014—2015年新疆家養(yǎng)動物小反芻獸疫病原學(xué)監(jiān)測

馬曉艷，王 文，李 舵，居馬別克·夏拉巴依，美熱木古麗·巴依待拉提，沙那瓦爾·塔西，盛卓君

（新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830063）

為了解新疆地區(qū)家養(yǎng)動物小反芻獸疫防控情況，對2014—2015年從新疆14個地州的種畜場、商品代養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶養(yǎng)殖場、交易市場及屠宰場采集的羊眼鼻分泌物等3 812份樣品，利用熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）方法，進行了小反芻獸疫病原學(xué)檢測，結(jié)果未檢測出病原學(xué)陽性樣品。監(jiān)測結(jié)果表明，新疆各地采取的小反芻獸疫防控措施行之有效，尤其是疫苗免疫對防控小反芻獸疫起到了關(guān)鍵性作用。

小反芻獸疫；熒光反轉(zhuǎn)錄–聚合酶鏈式反應(yīng)；監(jiān)測

小反芻獸疫（PPR）是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒（PPRV）引起的一種小反芻動物急性、高度接觸性傳染性疾病[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列入須通報動物疫病名錄，我國將其列為一類動物疫病，是《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》優(yōu)先防控的外來動物疫病之一。PPR目前主要分布在非洲和亞洲地區(qū)[2]，主要感染綿羊和山羊等小反芻動物，嚴重威脅養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)安全。該病的臨床表現(xiàn)與牛瘟類似，故也稱偽牛瘟（Pseudorinderpest），其特征是發(fā)病急劇、高熱稽留、眼鼻分泌物增加、口腔糜爛、腹瀉和肺炎。對于PPR的診斷，通常先是臨床檢查、病理剖檢及組織學(xué)觀察，然后采用實驗室方法確診?，F(xiàn)在已有多種血清學(xué)和分子生物學(xué)方法用于PPR檢測[3]。

2007年，PPR首次傳入我國西藏阿里地區(qū)。2013年11月底，PPR再次傳入我國，并波及多個省份，農(nóng)業(yè)部會同當(dāng)?shù)卣扇∮行Т胧杆倏刂屏艘咔閇4]。我國是養(yǎng)羊大國，年養(yǎng)殖量約為6億只。因此切實做好PPR防控工作，事關(guān)我國養(yǎng)羊業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，事關(guān)農(nóng)牧民的增收，意義重大。目前新疆已建立了百萬肉羊產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)基地，來保證養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，保障羊肉市場供給。因此，切實做好PPR防控，是今后新疆地區(qū)動物疫病防控工作的重中之重。

本研究主要對新疆14個地州的家養(yǎng)動物進行了PPR病原學(xué)監(jiān)測，為新疆PPR防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備。核酸提取儀（西安天隆有限責(zé)任公司）；熒光PCR儀（型號7500，ABI公司）；離心機（Sigma公司）。

1.1.2 試驗試劑。PPRV熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司，批號PPR20141128P、PPR20150528P、PPR20150626P、PPR20151108P。動物疫病病毒RNA自動核酸提取試劑盒（磁珠法），購自蘇州天隆生物科技有限公司，批號E0112102211、E0115040411。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品采集。按照隨機抽樣原則，在每個地州選擇1個縣，每個縣選取1～2個種羊場或養(yǎng)殖場、1～2個屠宰場、5個以上散養(yǎng)戶、1個交易市場，共計8～10個采樣點。每個采樣點，在春、秋各采集病原學(xué)樣品（眼、鼻棉拭子或組織樣品）5份。

1.2.2 病原學(xué)檢測方法

1.2.2.1 病毒RNA的提取。（1）在真空包裝的預(yù)封裝深孔板的第1、7列中，分別加入20 μL蛋白酶k、200 μL樣本。（2）按表1程序進行自動化提??；（3）自動化程序結(jié)束后，將第6、12列的洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈的，裝有滅菌無核酸酶的離心管中。

1.2.2.2 實時熒光RT-PCR擴增。設(shè)被檢樣品、陰性和陽性對照總和為N，反應(yīng)體系配制如下：滅菌無核酸酶水2.7×（N+1）μL， RT-PCR反應(yīng)液10×（N+1）μL，酶混合液 0.4×（N+1）μL，熒光探 1.9×（N+1）μL。將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝在每個反應(yīng)PCR管中各15 μL。分別取5 μL 模板RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標記，在熒光PCR儀上進行反應(yīng)：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min；循環(huán)95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40個次，在每次循環(huán)第2步（60 ℃ 35 s），收集熒光信號（報告基團“FAM”，淬滅基團“None”）。

表1 病毒RNA提取程序

1.3 結(jié)果判定

陽性對照Ct≤30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線，實驗結(jié)果成立；被檢樣品Ct≤30并出現(xiàn)特定的擴增曲線為PPR病毒陽性；被檢樣品30＜Ct＜37并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣提取RNA，擴增后進行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品Ct≥37時，判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 總體監(jiān)測情況

2014—2015年共監(jiān)測場點434個，涉及種畜場、商品代養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶、交易市場、屠宰場，共檢測PPR病原學(xué)樣品3 812份。各采樣場點采樣量占比分別為種畜場3.16%（120份）、商品代養(yǎng)殖場23.74%（905份）、散養(yǎng)戶50.28%（1 917份）、交易市場1.94%（74份）、屠宰場20.88%（796份）。具體采樣情況見表2、圖1。

2.2 病原學(xué)監(jiān)測情況

2014—2015年，利用熒光定量RT-PCR方法，共檢測PPR病原學(xué)樣品數(shù)3 812份，沒有檢測出陽性（表3）。

3 討論

一步法熒光定量RT-PCR方法被廣泛用于PPRV檢測[5-6]。熒光定量RT-PCR方法特異性好、敏感性高、檢測周期短、重復(fù)性很好[7]，其檢測快速、結(jié)果準確，能有效節(jié)約時間，為疫情的快速處置提供了保障，對大量的PPR樣品檢測提供了強有力的技術(shù)支撐，是一種行之有效的快速診斷方法。通常而言，患病羊只眼鼻分泌物中的PPRV含量較高，因此檢測時采集的樣品來源于此。

表2 2014—2015年集中監(jiān)測場點小反芻獸疫樣品的檢測數(shù)量及分布情況（單位：個/份）

圖1 2014—2015年病原學(xué)集中監(jiān)測場點采樣數(shù)比例

表3 2014—2015年小反芻獸疫病原學(xué)（熒光RT-PCR）集中監(jiān)測情況（單位：份/%）

從本研究的采樣分布情況看，采樣場點分布不均勻，監(jiān)測場點中的散養(yǎng)戶數(shù)量較多，其它場點采樣數(shù)量由多到少依次為規(guī)模場、屠宰場、種畜場、交易市場。上述監(jiān)測場點分布與新疆地區(qū)的飼養(yǎng)規(guī)模有關(guān)，主要是因為該地區(qū)的羊以傳統(tǒng)方式的散養(yǎng)為主。其它原因可能是沒有合理安排采樣場點，采取就近采樣原則，因此易選擇散養(yǎng)戶等易于采樣的場點。

為有效控制新疆PPR疫情，2014—2015年在新疆14個地州開展了PPR病原學(xué)監(jiān)測，沒有檢測到陽性樣品，這與新疆各個地州采取的免疫措施有關(guān)，家養(yǎng)動物免疫抗體水平保持在80%以上，疫苗免疫對防控PPR起到了關(guān)鍵性作用。

2014年至今，新疆PPR疫情呈逐年下降趨勢，自2014年9月，最后一起PPR疫情結(jié)束后，未再發(fā)生家養(yǎng)動物疫情。但從2014年底開始，新疆天山、昆侖山等地又發(fā)生了3起北山羊、盤羊、黃羊的野生動物PPR疫情。

PPR是重要的跨境動物疫病[8]，具有高度傳染性。2014年初，當(dāng)家羊大范圍發(fā)生疫情時，要求對全部家羊進行緊急免疫，而忽視了具有遷徙習(xí)性的野生羊已經(jīng)被感染可能。野生羊在遷徙過程中與家羊、放牧羊接觸，導(dǎo)致疫情擴散，進一步增加了野生羊感染PPR的概率，從而增大了野生羊在疫病傳播中的作用[9]。

時間和空間分析結(jié)果表明，野山羊PPR疫情在緩慢地沿天山山脈線路擴散。PPR病原已經(jīng)廣泛存在于該地區(qū)的野生動物中，目前疫情由野生動物向家養(yǎng)動物傳播的風(fēng)險較大。今后應(yīng)進一步做好疫源追蹤，在野生羊與家養(yǎng)動物接觸活動區(qū)域開展實時監(jiān)測，科學(xué)分析疫情形勢，為迅速有效撲滅疫情做好技術(shù)支撐。同時，還要與林業(yè)部門合工作，建立聯(lián)防聯(lián)控機制，做好野生羊疫區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查工作。

[1]ADAMA D. Peste des petits ruminants[EB/OL].（2015-01-08）[2016-12-07]. http://www.indiaveterinary community. com / profperspective.

[2] 王華，吳曉東，包靜月. 我國小反芻獸疫疫情現(xiàn)狀與防控策略[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2015，36（6）：142-155.

[3] 邱立新. 小反芻獸疫[J]. 湖南畜牧獸醫(yī)，2009（1）：1-2.

[4]陸則基，王志亮，劉雨田，等. 西藏阿里地區(qū)小反芻獸疫流行病學(xué)調(diào)查研究[J]. 中國動物檢疫，2008，25（12）：44-47.

[5]包靜月，李林，王志亮，等. 一步法實時定量RT-PCR檢測小反芻獸疫病毒方法的建立[J]. 中國動物檢疫，2007，24（8）：21-23.

[6]王琦，吳燕，文明，等. 小反芻獸疫一步法RT-PCR檢測方法的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，24（8）：11-15.

[7]呂建強，楊俊興，宗卉，等. 小反芻獸疫疫苗毒與野毒實時熒光RT-PCR鑒別檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，12（32）：1795-1798.

[8]王華，包靜月，吳曉東. 內(nèi)蒙古和西藏自治區(qū)野生反芻動物小反芻獸疫監(jiān)測[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2016，37（3）：124-126.

[9]夏咸柱，馬建章. 野生動物資源保護與疫病防控研究進行進展[M]. 北京：高等教育出版社，2009：120-125.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Pathogenic Surveillance of Peste des Petits Ruminants of Domestic Animals in Xinjiang during 2014—2015

Ma Xiaoyan，Wang Wen，Li Duo，Jumabieke Xialabayi，Meiremuguli Bayidailati，Shanawaer Taxi，Sheng Zhuojun
（Animal Health Supervision Institution of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi，Xinjiang 830063）

Objective to recognize the status of Peste des Petits Ruminants（PPR）control in domestic animals in Xinjiang，a total of 3 812 clinical samples of eye and nasal secretions were collected from sheep breeding farms，intensive farms，backyard farms，trading markets and the slaughterhouses in 14 prefecture-level cities of Xinjiang during 2014—2015，and then PPRV detection was conducted using real time quantitative RT-PCR（qRT-PCR）. Results showed all the samples were PPRV negative，which indicated the good effectivity of prevention and control measures，especially the critical role of PPR vaccination .

Peste des petits ruminants（PPR）；qRT-PCR；surveillance

S855.2

：B

：1005-944X（2017）05-0009-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.05.003

盛卓君