針刺“足三里”穴干預(yù)胃腸功能紊亂-腹瀉模型大鼠胃腸激素GAS、MTL水平的影響

李方高紡

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江，溫州 325000 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)省部共建新安醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室

針刺“足三里”穴干預(yù)胃腸功能紊亂-腹瀉模型大鼠胃腸激素GAS、MTL水平的影響

李方1高紡2

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江，溫州 325000 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)省部共建新安醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室

[目的］探討針刺足三里穴治療胃腸功能紊亂-腹瀉（functional gastrointestinal disorders-diarrhea，F(xiàn)GIDs-D）的機(jī)制。［方法］將40只大鼠分為正常對(duì)照組、模型組、足三里組（針刺雙側(cè)足三里）、非經(jīng)非穴組（針刺大鼠臀部兩處非經(jīng)非穴點(diǎn)），每組各10只。采用寒冷-束縛、饑飽失常綜合法復(fù)制FGIDs-D動(dòng)物模型。采用放免方法觀察各組大鼠血清及胃組織中胃泌素(Gastrin,GAS)、胃動(dòng)素（Motilin,MTL）的含量。［結(jié)果］與正常組比較，模型組大鼠血清及胃組織中GAS、MTL的含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，足三里組大鼠血清及胃組織中GAS、MTL的含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與非經(jīng)非穴組比較，足三里組大鼠血清及胃組織中GAS、MTL的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。［結(jié)論］針刺足三里穴對(duì)FGIDs-D具有明顯的改善作用，其作用機(jī)制與GAS、MTL有密切關(guān)系。

胃腸功能紊亂；腹瀉；足三里；針刺；GAS；MTL；機(jī)制

刺足三里穴治療FGIDs-D的作用機(jī)制，同時(shí)為臨床治療提供更好的選穴依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

胃腸功能紊亂（functional gastrointestinal disorders, FGIDs）又稱胃腸神經(jīng)官能癥，是一組胃腸綜合征的總稱，主要包括功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)、腸易激綜合征(irritable bowel Syndrome，IBS)。胃腸道的發(fā)病數(shù)在各種臟器的神經(jīng)官能癥中最高,多見于青壯年。而對(duì)于其治療，則給社會(huì)、家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和負(fù)擔(dān)[1]。另外，目前對(duì)本癥的發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，其機(jī)理則均處于假說階段，尤其腦-腸之間的聯(lián)系及相關(guān)理論尚不清楚。因此，尋求治療該病的有效方法及探究該病的發(fā)生機(jī)制成為醫(yī)學(xué)界的熱門話題。本研究以觀察針刺足三里穴對(duì)胃腸功能紊亂（functional gastrointestinal disorders-diarrhea，F(xiàn)GIDs-D）大鼠血清及胃組織中胃泌素（Gastrin, GAS）、胃動(dòng)素（Motilin,MTL）含量的影響，來探討針

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康、清潔級(jí)SD大鼠40只，雌雄不拘，體質(zhì)量180-200g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(蘇)2008-0004。

1.2 主要儀器 XD-20制冰機(jī)(寧波新芝)，超純水機(jī)（美國密理博 Milli-Q Refrence）。GAS、MTL放免試劑盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供。T25高速分散勻漿機(jī)（德國 IKA），2-16PK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國 Sigma），MDF-U5386S超低溫冰箱(日本三洋)，SN-694B放射免疫γ測(cè)量儀（中國科學(xué)院上海原子能研究所），PCE-A型程控電針治療儀（安徽天恒有限公司制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 水合氯醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），批號(hào)20150403，GAS、MTL放免試劑盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與模型復(fù)制 40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、非經(jīng)非穴組和足三里組，每組各10只。采用改良寒冷-束縛、饑飽失常綜合法復(fù)制FGIDs-D動(dòng)物模型[2]。應(yīng)用多種刺激方法，使大鼠長期處于應(yīng)激狀態(tài)。①束縛敷冰法：用細(xì)棉線綁住大鼠的四肢，并固定于小鐵籠蓋上1h，將棒棒冰置于大鼠腹部，期間密切觀察大鼠的生命狀態(tài)，束縛不宜過緊，待接觸的棒棒冰有融化時(shí)，移至未融化的另一端。②冰水灌胃法：取出冰箱中冷凍的蒸餾水，待其融化至冰水混合物時(shí)，每只大鼠按10mL·kg-1的劑量灌胃。③冰水游泳法：把大鼠放進(jìn)灌有15cm高度0℃冰水透明玻璃裝置中5 h，期間對(duì)大鼠實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，以防大鼠疲倦淹死。④饑飽失常法：逢單日給食，雙日禁食，均正常飲水。以上4種方法，3d為1輪，除饑飽失常法每天使用外，其余均與束縛敷冰法交替使用。即第1天束縛敷冰、給食，第2天冰水灌胃、禁食，第3天冰水游泳、給食，刺激6輪共計(jì)18天。造模期間，每天密切觀察大鼠的一般狀況及體質(zhì)量變化。第18天刺激結(jié)束后，①出現(xiàn)便溏，四肢無力,動(dòng)作遲緩,反應(yīng)遲鈍,毛發(fā)失去正常光澤而枯槁、疏散，②模型組體質(zhì)量在造模前后比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，滿足①②條件的大鼠作為模型復(fù)制成功并納入實(shí)驗(yàn)。除正常對(duì)照組外，其他組均造模。模型復(fù)制評(píng)價(jià)成功后，立即針刺，非經(jīng)非穴組和足三里組連續(xù)針刺7天，正常對(duì)照組、模型組不予針刺。

2.2 針刺方法 腧穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]：足三里穴，后肢膝關(guān)節(jié)下方，當(dāng)腓骨小頭內(nèi)約5mm處，直刺進(jìn)針深度約7mm；非經(jīng)非穴：選取大鼠臀部非經(jīng)非穴點(diǎn)兩處（臀大肌外上象限內(nèi)，按文獻(xiàn)[3]無經(jīng)絡(luò)和穴位處），用Φ0.30×25mm毫針分別各刺入2根，并聯(lián)連至電針治療儀。兩組刺激參數(shù)一致電流均為1.1mA，頻率均為2Hz，連續(xù)電針20min。約24h 1次，共7次。正常對(duì)照組、模型組不予電針。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 于末次針刺完禁食12h后取血和取胃竇組織一塊。用放免法檢測(cè)血清中GAS、MTL和胃組織中GAS、MTL。（1）血液:經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，置于含有7.5%乙二胺四乙酸二鈉和抑肽酶500U·mL-1試管中輕緩混勻，靜置 30 min后，4℃，3500r/min離心10min，收集血清，取上清測(cè)定，-70℃低溫保存。待標(biāo)本收集完畢，按放免藥盒說明嚴(yán)格操作。血樣測(cè)量值的計(jì)算是將血樣的放射性記數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比后確定，由自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀預(yù)編程序，直接給出有關(guān)參數(shù),標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。（2）組織:取大鼠胃竇組織一塊，放入稱量瓶中，稱重后加入生理鹽水1ml，沸水煮10 min，加0.1moL·L-1醋酸1.0mL，倒入勻漿管中，用離散器勻漿，取上清液0.1mL·L-1Na0H滴定pH至7.4，離心(4℃,4000r/min 20min)，-70℃保存待測(cè)激素。

3 結(jié)果

3.1 針刺對(duì)模型大鼠血清GAS、MTL的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中GAS、MTL的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，非經(jīng)非穴組大鼠血清中GAS、MTL的含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而足三里組是顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與非經(jīng)非穴組比較，足三里組大鼠血清中GAS、MTL的含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3.2 針刺對(duì)模型大鼠胃組織GAS、MTL的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胃組織中GAS、MTL的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，非經(jīng)非穴組大鼠胃組織中GAS、MTL的含量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而足三里組的含量變化顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與非經(jīng)非穴組比較，足三里組大鼠胃組織中GAS、MTL的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

4 討論

祖國醫(yī)學(xué)根據(jù)胃腸功能紊亂疾病臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“郁證”、“噯氣”、“泄瀉”、“便秘”、“胃脘痛”、“腹痛”、“嘔吐”等范疇之中。其病位在胃腸，治療當(dāng)以針刺足三里穴為主，足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴、胃的下合穴，是治療胃腸疾病的要穴，具有調(diào)理脾胃、通腑導(dǎo)滯等功效，凡一切胃腸疾病，不論虛、實(shí)、寒、熱之證，都可針灸足三里治療。在臨床實(shí)踐中，足三里穴為臨床應(yīng)用最廣泛的穴位，已有研究表明，針灸足三里穴可以增加白細(xì)胞總數(shù)，且增強(qiáng)其吞噬能力[4]。另外可提高機(jī)體各種特異性和非特異性的免疫力，增強(qiáng)人體防御能力[5]。故本研究選取足三里作為針刺腧穴。

表1 針刺對(duì)FGIDs-D模型大鼠血清GAS、MTL的影響（±s，pg·mL-1）Tab.1 Effects of electroacupuncture on levels of serum Motilin and Gastrin in FGIDs-D model rats（±s，pg·mL-1）

表1 針刺對(duì)FGIDs-D模型大鼠血清GAS、MTL的影響（±s，pg·mL-1）Tab.1 Effects of electroacupuncture on levels of serum Motilin and Gastrin in FGIDs-D model rats（±s，pg·mL-1）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與非經(jīng)非穴組比較，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group,**P＜0.01;Compared with model group,##P＜0.01;Compared with non-acupuncture point group,△△P＜0.01.

組別 n GAS MTL正常對(duì)照組模型組非經(jīng)非穴組足三里組10 10 10 10 72.38±6.83 54.09±6.16**56.55±8.59 71.83±8.10##△△478.66±29.27 357.06±44.89**355.46±31.38 491.74±18.18##△△

表2 針刺對(duì)FGIDs-D模型大鼠胃組織GAS、MTL的影響（±s,pg·mL-1）Tab.2 Effects of electroacupuncture on levels of stomach tissue Motilin and Gastrin in FGIDs-D model rats（±s，pg·mL-1）

表2 針刺對(duì)FGIDs-D模型大鼠胃組織GAS、MTL的影響（±s,pg·mL-1）Tab.2 Effects of electroacupuncture on levels of stomach tissue Motilin and Gastrin in FGIDs-D model rats（±s，pg·mL-1）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與非經(jīng)非穴組比較，△△P＜0.01。Note:Compared with normal group,**P＜0.01;Compared with model group,##P＜0.01;Compared with non-acupuncture point group,△△P＜0.01.

組別 n GAS MTL正常對(duì)照組模型組非經(jīng)非穴組足三里組10 10 10 10 219.72±18.36 95.69±10.39**99.26±11.25 216.97±28.75##△△90.77±13.33 49.91±8.58**55.04±8.68 87.90±6.46##△△

胃腸道功能紊亂的發(fā)生與胃腸激素分泌關(guān)系密切[6]。GAS能使胃粘膜血流加強(qiáng)，促使粘膜上皮細(xì)胞中DNA的合成，使細(xì)胞分裂增快，泌酶、泌酸功能增強(qiáng)。GAS也可促進(jìn)胃腸道的運(yùn)動(dòng)。近年來研究顯示，針刺對(duì)GAS的分泌也有調(diào)節(jié)作用。 如滕金艷等[7]電針“百會(huì)”“印堂”提高抑郁模型大鼠的結(jié)腸黏膜腦腸肽GAS的分泌。王昕等[8]針刺“足三里”，結(jié)果顯示針刺“足三里”可使脾虛大鼠血清中GAS、皮質(zhì)醇、睪酮的水平升高。李彤彤等[9]針刺不同穴位對(duì)脾氣虛大鼠能顯著升高鼠血清GAS，有效改善脾氣虛證。MTL作為一種重要的腦腸肽和胃腸激素，對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)和某些消化液的分泌具有重要的生理意義。如針刺胃俞募穴可明顯增強(qiáng)大鼠胃運(yùn)動(dòng)，且采用俞募配穴進(jìn)行針刺，其作用更為顯著，且血清中MTL、GAS分泌水平發(fā)生明顯變化[10]。羊燕群等[11]研究針刺足三里對(duì)FD胃排空及血清MTL和GAS影響,發(fā)現(xiàn)針刺足三里對(duì)胃腸動(dòng)力具有促進(jìn)作用，此與恢復(fù)FD大鼠的MTL、GAS分泌水平有關(guān)。到目前為止,臨床上西醫(yī)采用藥物治療FGIDs-D療效不甚理想,然針刺治療該病療效顯著并被推廣，但該病發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí),故本研究希望通過針刺腧穴調(diào)節(jié)胃腸激素GAS、MTL的分泌治療FGIDs-D作進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，造模后各組大鼠血清及胃組織中GAS、MTL的含量明顯降低，而針刺足三里穴能明顯提高其含量，對(duì)胃腸功能紊亂腹瀉模型大鼠胃腸激素具有良性調(diào)節(jié)作用。同時(shí)證明足三里穴與胃腸有著特異性關(guān)系，具有穴位的特異性。

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Effects of Electroacupuncture at ST36 on Levels of Gastrointestinal Hormone Motilin and Gastrin in FGIDs-D Model Rats

LI Fang1,GAO Fang21. Rehabilitation Medicine Institute of the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,ZheJiang(325000);2.Key Laboratory of Xin’an Medicine,Ministry of Education,AnHui University of TCM

[Objective]To explore the mechanism of acupuncture at Zusanli point(ST36)in the treatment of functional gastrointestinal disorders(FGIDs). [Methods]A total of 40 Wistar rats were randomized into normal(n=10),model(n=10),Zusanli point(ST36),non-acupuncture point(n=10).FGIDs model was established by exerting the factors of cold-constraint stimulation and hunger disorder synthesis.And the content of rats serum and stomach tissue Gastrin (GAS)and Motilin(MTL)was observed by radioimmuno-assay.[Results]Compared with the normal group,the content of rats serum and stomach tissue GAS and MTL of the model group was significantly reduced(P＜0.01);Compared with the model group,the content of rats serum and stomach tissue GAS and MTL of ST36 group was significantly ascended(P＜0.01);Compared with the non-acupuncture point group,the content of rats serum and stomach tissue GAS and MTL of ST36 group had statistically significant differences(P＜0.01).[Conclusion]Acupuncture at ST36 had obvious improvement in FGIDs,its mechanism was closely related to GAS and MTL.

FGIDs;diarrhea;ST36;acupuncture;GAS;MTL;mechanism

R245.9

A

1005-5509（2017）04-0271-03

10.16466/j.issn1005-5509.2017.04.002

2016-11-22）

安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研項(xiàng)目（2014zr002）

Fund project:Scientific research project program of AnHui University of TCM（2014zr002）

高紡，E-mail:gf19840920@126.com