鋅指蛋白703在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

李丁，劉閣玲，楊曉琳

(華北理工大學附屬唐山市工人醫(yī)院內分泌一科，河北唐山063000)

鋅指蛋白703在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

李丁，劉閣玲，楊曉琳

(華北理工大學附屬唐山市工人醫(yī)院內分泌一科，河北唐山063000)

目的研究鋅指蛋白703(ZNF703)在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(包括陽性率及相對表達量)及陽性率與臨床特征的關系。方法應用免疫組織化學法(pv9000法)檢測組織芯片(包括36例甲狀腺乳頭狀癌及14例癌旁正常組織)中ZNF703的陽性表達率，并分析癌組織中的陽性表達率與芯片包含的相關臨床資料(年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期)之間的關系。另收集20例臨床新鮮甲狀腺乳頭狀癌及匹配癌旁組織樣本，應用Western blot及RT-PCR技術檢測ZNF703在20對組織樣本的蛋白和mRNA相對表達量。結果免疫組化提示ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌的陽性表達率為66.7%，較癌旁組織的21.4%明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；癌組織陽性表達率與年齡、性別無關，與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移有關(P＜0.05)。Western blot及RT-PCR提示ZNF703在20例甲狀腺乳頭狀癌組織的蛋白相對表達量[(0.893±0.113)vs(0.510±0.072)]及mRNA相對表達量[(6.399± 2.096)vs(1.285±0.354)]均高于匹配癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌中的表達高于癌旁組織，并且在癌組織中ZNF703陽性率高低與患者臨床分期、淋巴結轉移及腫瘤大小有關，可見ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生及進展中可能發(fā)揮促進作用。

甲狀腺乳頭狀癌；鋅指蛋白703；癌旁組織

近年來我國甲狀腺癌的發(fā)病率不斷上升[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的亞型，在沿海及高碘地區(qū)，其發(fā)病比例已達90%以上[2]。人類鋅指蛋白廣泛表達于真核生物中，作為轉錄抑制因子，調節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡等過程[3-4]，ZNF703(鋅指蛋白703)為鋅指蛋白家族成員，基因定位于染色體8區(qū)域(8p11.23)[5]，是新發(fā)現(xiàn)的乳腺癌致癌因子，伴隨表達量升高，患者預后變差[6]。隨后國內外研究中相繼發(fā)現(xiàn)了ZNF703在人類子宮內膜癌、大腸癌、胃癌、頭頸部鱗癌中均有較高表達，發(fā)揮致癌作用[7-10]。目前ZNF703在甲狀腺癌中的表達情況國內外無相關報道，本文擬通過檢測ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中的表達情況，并分析其與臨床預后的相關性，進一步研究ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源組織芯片(TH242、TH808)購買于美國US Biomax公司，其中甲狀腺乳頭狀癌36例，甲狀腺癌旁正常組織14例。芯片包含相關臨床資料。乳頭狀癌組患者男性6例，女性30例；年齡≥45歲者15例，＜45歲者21例；腫瘤直徑≤4 cm者21例，直徑＞4 cm者15例；淋巴結轉移者8例，淋巴結未轉移者28例；依據(jù)AJCC癌癥分期手冊第七版標準：臨床分期Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期9例。20例甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織標本均取材于唐山開灤總醫(yī)院2016年3～10月期間手術切除的腫瘤，癌旁組織取材處距離癌組織邊緣≥3 cm，患者均為初次手術，術前無放療、化療及其他免疫治療。組織樣本均在離體后半小時內放于液氮中速凍，后轉移至-80℃冰箱長期保存，取材組織均經過術中冰凍病理檢測，確認為甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑兔抗人單克隆抗體ZNF703 (ab188031)、兔抗人多克隆抗體ZNF703(ab137054)均購自美國abcam公司，兔抗人多克隆抗體B-actin購自中國華安生物公司，通用型抗體PV9000試劑盒(兩步法)購自北京中衫金橋生物有限公司。Trizol、cDNA逆轉錄試劑盒、SYBRTMGreen定量試劑盒均購于Invitrogen公司。ECL超敏發(fā)光檢測試劑盒購自美國novex公司。

1.2.2 免疫組化染色及結果判定采用乳腺癌石蠟切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗進行陰性對照。將待測芯片脫蠟水化、抗原修復、內源性封閉，一抗抗體ZNF703(ab188031)稀釋度1:50滴加組織，4℃孵育過夜，通用型二抗PV9000及DAB顯色試劑盒均按照說明書嚴格操作。ZNF703蛋白的染色表達主要位于細胞核，陽性呈棕黃色。以陽性細胞率評分和染色強度評分為判定標準：染色細胞≤10%為0分；染色細胞在11%～30%為1分；染色細胞在31%～50%為2分；染色細胞在50%以上為3分；細胞核染色強度無染色計0分，染淺黃色計1分，棕黃色計2分，深棕色計3分，兩項分數(shù)相加后≤1分為陰性，其余視為陽性表達。

1.2.3 實時熒光定量PCR操作步驟及檢測方法稱取儲存于-80℃冰箱的癌及癌旁組織各80 mg，采用TRizol法提取RNA，嚴格按逆轉錄試劑盒說明書要求合成cDNA，擴增總反應體系為20 μL，其中cDNA(1 000 ng/μL)模板加入2 U，左右引物各1 U，SYBRTMGreen擴增Mix 10 U，無酶水6 U，反應條件為95℃2 min預變性，45個循環(huán)：變性95℃15 s，退火及延伸60℃30 s，以GAPDH基因作為內參。設置癌組織為試驗組，癌旁組織為對照組，隨機抽取一例對照組樣品為代表1倍目基因表達量的校正樣品，以2-△△CT法計算其他樣品相對表達量。引物：ZNF703(F 5'-AACGGCCCACATGAGTCAAT-3'R5'-GGCGGGGA TCATGTCGTTAT-3')，GAPDH(F5'-GAAAGCCTGCCG GTGACTAA-3'R5'-AGGAAAAGCATCACCCGGAG)。

1.2.4 Western blot操作步驟及檢測方法稱量-80℃冰箱的癌及癌旁組織各60 mg，1 mL裂解液+ 4 μL PSMF充分裂解組織，離心，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度，統(tǒng)一每孔上樣量為30 μg進行SDS-PAGE，穩(wěn)流低溫電轉至硝酸纖維素膜條帶上，5%脫脂牛奶封閉條帶1 h，加入一抗(ZNF703 (ab137054)1:2 000稀釋，抗體B-actin1:1 000稀釋)4℃孵育過夜，加入二抗兔抗人熒光標記抗體，37℃孵育30 min，加入ECL發(fā)光劑顯影，以Image J軟件計算條帶的灰度值，蛋白相對表達量用ZNF703與GAPDH條帶的灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以四格表表示，其中陽性表達率結果采用χ2檢驗，癌組織陽性表達率與臨床特征關系采用Fisher確切概率法。計量資料以均數(shù)±標準差()表示，兩組間比較采用配對樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果圖1的染色結果顯示，ZNF703主要在胞核內表達。ZNF703在36例甲狀腺乳頭狀癌組織中24例陽性表達，表達率為66.7%，在14例甲狀腺正常組織中3例陽性表達，表達率為21.4%，見表1。

圖1 免疫組織化學檢測ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織的表達(200×)

表1 ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中的表達率（例）

2.2 ZNF703的陽性表達率與臨床病理特征的相關性ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性表達率與患者的年齡、性別無顯著相關性，與患者的腫瘤大小、淋巴結轉移及臨床分期相關(P＜0.05)，見表2。

表2 ZNF703陽性表達率與甲狀腺乳頭狀癌臨床特征的關系(例)

2.3 實時熒光定量PCR及Western blot檢測結果RT-PCR檢測結果(圖2)和Western blot檢測結果(圖3)顯示，ZNF703在20例甲狀腺乳頭狀癌中的mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均高于匹配癌旁組織，差異均具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

圖2 RT-PCR檢測ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織的相對表達量

圖3 Western blotting檢測ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織中的相對表達量

表3 ZN03在20例癌組織及癌旁組織中蛋白及mRNA相對表達量()

表3 ZN03在20例癌組織及癌旁組織中蛋白及mRNA相對表達量()

組別甲狀腺乳頭狀癌匹配癌旁組織t值P值蛋白相對表達量0.893±0.113 0.510±0.072 21.519 0.000 mRNA相對表達量6.399±2.096 1.285±0.354 12.214 0.000

3 討論

Lin等[11]發(fā)現(xiàn)雌激素反應元件ERB(Erb B2)和細胞周期蛋白D1(CCND1)作用于ZNF703啟動子區(qū)域，表明ZNF703可能受到雌激素與CCND1下游調節(jié)，然而CCND1和雌激素與人體甲狀腺癌發(fā)生高度相關，均發(fā)揮促進癌變作用[12-13]，這提示ZNF703很可能參與了甲狀腺癌發(fā)生的分子通路中。本研究檢測了ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ZNF703在乳頭狀癌中的表達明顯高于癌旁組織，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期相關，這與ZNF703在乳腺癌、大腸癌、胃癌等研究的結果是一致的。ZNF703在人體多器官中發(fā)揮癌基因的作用，提示我們ZNF703可能參與經典致癌通路。

ZNF703的致癌作用可能與其參與細胞周期調控有關，Sircoulomb等[14]發(fā)現(xiàn)ZNF703過度表達促使乳腺癌MCF7細胞中RB1磷酸化，下調P27kip1蛋白，上調E2F1(細胞周期相關轉錄因子)和CCNE1(G1/S特異性細胞周期蛋白E1)的表達，誘發(fā)細胞從G1期跳脫R點的限制作用而進入S期，促進細胞惡性增殖而致癌。此外，ZNF703可以抑制TGFβ受體Ⅱ的活性及E鈣粘蛋白的表達，上調親遷徙性P120連環(huán)亞蛋白表達，促進細胞的增殖及遷移，使癌細胞更具有侵襲性[14]，這也解釋了ZNF703在乳腺癌、胃癌中隨著表達的升高，腫瘤直徑增大，淋巴結轉移情況更多見。另外Holland等[15]發(fā)現(xiàn)ZNF703刺激小鼠胚胎成纖維細胞轉化為成纖維細胞，而成纖維細胞是一個典型的促癌因子，在人類管腔乳腺癌細胞系中有規(guī)律的擴增，增強乳腺癌管腔細胞轉化為干細胞的頻率，這也提示ZNF703可能參與了癌細胞的分化調控，具體機制有待研究。

綜上所述，ZNF703在甲狀腺乳頭狀癌中的表達明顯高于癌旁組織，且相關臨床預后，所以可能充當致癌因子角色。ZNF703受到雌激素調節(jié)，參與調節(jié)細胞生長周期，因此通過對ZNF703作用機制的深入探索，有望為甲狀腺乳頭狀癌的激素和分子靶向治療提供一定的實驗依據(jù)。

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Expression of zinc finger protein 703 in papillary thyroid carcinoma and its significance.

LI Ding,LIU Ge-ling, YANG Xiao-lin.First Department of Endocrinology,Tangshan Municipal People's Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo study the expressions(including the positive rate and the relative expression)of zinc finger protein 703(ZNF703)in papillary thyroid carcinoma and the relationship between the positive rate and the related clinical characteristics.MethodsImmunohistochemistry PV-9000 method was used to detect the positive expression rate of ZNF703 in tissue chips(including 36 cases of papillary thyroid carcinomas,14 cases of para-carcinoma tissues), and the relationship between the positive expression rates of ZNF703 in papillary thyroid carcinomas and clinical characteristics included by the chip(including age,gender,tumor size,lymph node metastasis,clinical stage)was analyzed.In addition,20 cases of clinical fresh papillary thyroid carcinomas and para-carcinoma tissues were collected.Western blot and RT-PCR were used to detect the relative expressions of protein and mRNA of ZNF703 in 20 pairs of cases papillary thyroid carcinomas and para-carcinoma tissues.ResultsImmunohistochemistry study showed that the positive expression rate of ZNF703 in papillary thyroid carcinoma(66.7%)was significantly higher than that in para-carcinoma tissues (21.4%)(P＜0.05).The positive rate of papillary thyroid carcinomas was correlated with tumor size,lymph node metastasis,clinical stage(P＜0.05),and was not related to age,gender.Western-blot and RT-PCR indicated that the relative expression of protein and mRNA of ZNF703 in 20 cases of papillary thyroid carcinomas were respectively(0.893±0.113) and(6.399±2.096),which were significantly higher than(0.510±0.072)and(1.285±0.354)in matched para-carcinoma tissues(P＜0.05).ConclusionThe expression of ZNF703 in papillary thyroid carcinoma is higher than that in para-carcinoma tissue,and the positive rate of ZNF703 in cancer tissues is correlated with clinical stage,lymph node metastasis and tumor size.So ZNF703 may play a carcinogenic role in the occurrence and development of papillary thyroid cancer.

Thyroid papillary carcinoma;Zinc finger protein 703(ZNF703);Para-carcinoma tissues

R736.1

A

1003—6350（2017）07—1104—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.026

2016-11-06)

李丁。E-mail：870745784@qq.com