1株紅樹內(nèi)生真菌Fusarium sp.代謝產(chǎn)物的研究

李文生， 周丹麗， 陸盈池， 鐘浩然， 朱新偉， 丁唯嘉， 李春遠(yuǎn)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642)

1株紅樹內(nèi)生真菌Fusarium sp.代謝產(chǎn)物的研究

李文生， 周丹麗， 陸盈池， 鐘浩然， 朱新偉， 丁唯嘉， 李春遠(yuǎn)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【目的】研究紅樹林鐮刀菌屬真菌Fusariumsp.R5的代謝產(chǎn)物?！痉椒ā坎捎霉枘z柱層析分離純化代謝產(chǎn)物，波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)，濾紙片擴(kuò)散法測(cè)試抗植物病原真菌活性?！窘Y(jié)果】分離鑒定5-羥甲基-2-呋喃甲醛(化合物1)，(3R,4R)-順-4-羥基蜂蜜曲菌素(化合物2)，(3R,4R)-順-4,7-二羥基蜂蜜曲菌素(化合物3)，Clavatol(化合物4)，酒渣堿(化合物5)，麥角甾-4, 6, 8(14), 22-四烯-3酮(化合物6),β-谷甾醇(化合物7)、3β-膽甾-5-烯-3-醇(化合物8)、丁二酸和順丁烯二酸10個(gè)化合物。在250 μg·mL-1時(shí)，化合物5對(duì)香蕉炭疽菌Colletotrichummusae高度抗菌，化合物5和6對(duì)番茄枯萎菌F.oxysporum、小麥赤霉菌F.graminearum中度抗菌。【結(jié)論】從Fusarium屬分離得到化合物1～8,其中，化合物5、6可作為相應(yīng)農(nóng)藥抗菌先導(dǎo)化合物開展深入研究。

紅樹內(nèi)生真菌；Fusariumsp.； 代謝產(chǎn)物； 抗真菌活性

各種真菌引起的病害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品保藏造成了嚴(yán)重的危害，如番茄枯萎病使番茄葉片自下而上變黃、變褐，從而造成果實(shí)質(zhì)量下降或減產(chǎn)[1]。香蕉炭疽病使果實(shí)在短期內(nèi)變黑、腐爛，在種植后期或貯運(yùn)期間損失尤為嚴(yán)重[2]，小麥赤霉病主要引起苗枯、莖基腐、稈腐和穗腐，其中穗腐造成了嚴(yán)重的小麥減產(chǎn)[3]。目前對(duì)植物真菌病害的防治主要是依靠化學(xué)合成農(nóng)藥，但長(zhǎng)期頻繁地使用化學(xué)合成農(nóng)藥，不僅使病原菌抗藥性增強(qiáng)，而且?guī)砹宿r(nóng)藥殘留問題，造成環(huán)境污染[4]。為克服化學(xué)合成農(nóng)藥的缺點(diǎn)，有必要從天然植物或微生物代謝產(chǎn)物中尋找安全無公害的替代品。近年來，已從微生物代謝產(chǎn)物中分離到許多具有抗植物病原菌活性的化合物[5-7]。鐮刀菌屬真菌Fusariumsp.是一類在自然界分布廣泛的微生物，已從該屬菌中獲得了抗植物病原菌、抗氧化、抗腫瘤等的活性物質(zhì)[8-9]。在對(duì)采集自湛江沿海半紅樹植物苦檻藍(lán)Myoporumbontioides內(nèi)生真菌的研究中，丁唯嘉等[10]發(fā)現(xiàn)分離自根部的Fusariumsp. R5在液體培養(yǎng)時(shí)其粗提取物顯示了較好的抗植物病原真菌活性。因此進(jìn)一步開展了該菌代謝產(chǎn)物的研究，以尋找相應(yīng)的抗菌先導(dǎo)化合物。本文研究了真菌Fusariumsp. R5代謝產(chǎn)物的分離、鑒定、抗菌活性測(cè)試等內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

AV 600核磁共振波譜儀(瑞士Bruker Biospin AG公司)； APCI 2000液質(zhì)聯(lián)用儀(加拿大MDS SCIEX公司)； SEPA-300旋光儀(日本Horiba公司)；薄層層析和柱層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)，所用試劑均為市售分析純。

真菌Fusariumsp. R5采集自廣東湛江紅樹林植物苦檻藍(lán)的根部，通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行了初步鑒定[10]。植物病原菌番茄枯萎菌F.oxysporumSchlecht. f. sp. lycopersici (Sacc.) W.C. Snyder et H.N. Hansen、小麥赤霉菌F.graminearumSchw.和香蕉炭疽菌Colletotrichummusae(Berk.&M. A. Curtis) Arx引種自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，以上菌株均保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院。

1.2 菌種鑒定及發(fā)酵

將純的單孢菌接種在馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基上，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。4 d后觀察其生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)， 15 d后觀察大、小型分生孢子。綜合觀察的形態(tài)特征，初步鑒定到屬。接著采用PCR 擴(kuò)增真菌核糖體ITS 基因區(qū)段進(jìn)行真菌鑒定的方法[11]，對(duì)菌株的菌屬進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。用CTAB法提取總DNA[12]，用rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)與ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[13]進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：TaqPlus PCR MasterMix [天根生化(北京)科技有限公司] 25 μL，上游引物和下游引物各2 μL，模板DNA(10 ng) 1 μL，ddH2O 21 μL，總體積50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共30個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因醫(yī)學(xué)有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序的核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast相似性比對(duì)。在顯示出的結(jié)果中，排列在最前面匹配最高的菌屬鑒定為該樣品菌屬。最后綜合2種方法結(jié)果確定菌株的菌屬。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨2 g·L-1，酵母膏1 g·L-1，粗海鹽2 g·L-1，pH為7。在500 mL錐形瓶中裝入培養(yǎng)液300 mL，于121 ℃，0.1 MPa高溫高壓滅菌30 min后接種，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)30 d，過濾，收集發(fā)酵液和菌體，共培養(yǎng)150 L。

1.3 代謝物提取與分離

發(fā)酵液過濾除去菌絲后，用乙酸乙酯萃取，共萃取4次，減壓濃縮萃取液，合并濃縮液，經(jīng)硅膠柱層析， 以石油醚-乙酸乙酯(體積比100∶0～0∶100)、乙酸乙酯-甲醇(體積比100∶0～0∶100)系統(tǒng)梯度洗脫，在V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) = 35 ∶ 65時(shí)得到化合物1 (25 mg)；在V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) = 65∶35時(shí)得到化合物2和3的粗品，再經(jīng)硅膠制備薄層色譜，在V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) = 75∶25時(shí)得到化合物2 (5 mg)和3 (4 mg)；在V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) = 75 : 25時(shí)得到化合物4的粗品，再經(jīng)重結(jié)晶得到化合物4 (10 mg)；在V(乙酸乙酯) ∶V(甲醇) =80∶20時(shí)分離得到化合物5 (8 mg)；在V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)= 90∶10時(shí)得到化合物6 (25 mg)；在V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) = 85∶15時(shí)得到化合物7和8的粗品，再經(jīng)重結(jié)晶得到化合物7 (12 mg)和8 (14 mg)；在V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)= 50∶50時(shí)得到化合物9 (18 mg)和10 (7 mg)。

1.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過分析化合物的氫譜(1HNMR)、碳譜(13C NMR)、質(zhì)譜(ESIMS)等試驗(yàn)數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)對(duì)照或與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照薄層和熔點(diǎn)等，鑒定化合物1～10的結(jié)構(gòu)。

1.5 化合物抗菌活性測(cè)試

采用濾紙片擴(kuò)散法[14]測(cè)試部分化合物對(duì)番茄枯萎菌、香蕉炭疽菌、小麥赤霉菌的抗菌活性，接種后28 ℃條件下培養(yǎng)，番茄枯萎菌、香蕉炭疽菌培養(yǎng)48 h，小麥赤霉菌培養(yǎng)24 h，用多菌靈作為陽性對(duì)照，用溶解化合物的溶劑(體積分?jǐn)?shù)為5%的二甲基亞砜)為空白對(duì)照。抑菌圈直徑用十字交叉法測(cè)量，每種樣品同一植物病原菌在每個(gè)培養(yǎng)皿上測(cè)試2組，重復(fù)3次，最終以6組抑菌圈數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)和相關(guān)性分析，差異顯著性分析采用鄧肯氏多重差異比較(Duncan’s multiple range tests)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株菌屬鑒定結(jié)果

菌株在最初分離得到時(shí)已通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行了初步鑒定[10]，其菌株培養(yǎng)性狀為：在PSA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h菌落為白色，菌絲呈棉絮狀，隨后菌落顏色逐漸變紅，顏色隨時(shí)間延長(zhǎng)而加深，約5 d后菌絲表面呈粉狀，培養(yǎng)基表面和內(nèi)部呈現(xiàn)玫瑰色，后期布滿整個(gè)培養(yǎng)皿。形態(tài)特征: 培養(yǎng)15 d后大型分生孢子呈彎曲鐮刀狀，頂漸尖，足細(xì)胞較明顯，5～10個(gè)隔膜，(6.8～8.9) μm × (40.7～44.6) μm。小型分生孢子數(shù)量多，呈鏈狀、卵形、橢圓形、圓柱形，(2.9～4.9) μm × (1.5～2.8) μm，0～1個(gè)隔膜。與文獻(xiàn)[15-16]對(duì)照符合鐮刀菌屬特征。進(jìn)一步用PCR 擴(kuò)增真菌核糖體ITS 基因區(qū)段的方法驗(yàn)證菌株的菌屬，DNA測(cè)序結(jié)果與NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為FJ037750.1，EU797070.1，HM535409.1和KM231809.1的鐮刀屬菌相似度均為99%。此結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果吻合，進(jìn)一步證實(shí)該菌株屬于鐮刀菌屬。菌株暫未鑒定到種。

2.2 化合物的試驗(yàn)波譜數(shù)據(jù)

本文共分離鑒定了10種化合物，分別為5-羥甲基-2-呋喃甲醛(化合物1)，(3R,4R)-順-4-羥基蜂蜜曲菌素(化合物2)，(3R,4R)-順-4,7-二羥基蜂蜜曲菌素(化合物3)，Clavatol(化合物4)，酒渣堿(化合物5)，麥角甾-4, 6, 8(14), 22-四烯-3酮(化合物6)，β-谷甾醇(化合物7)，3β-膽甾-5-烯-3-醇(化合物8)，丁二酸和順丁烯二酸。其化合物1～8的波譜數(shù)據(jù)如下：

化合物1：黃色油狀物。 ESIMS(m/z): 125 [M-H]-。1H NMR (600 MHz, CD3COCD3)δ9.59 (s, 1H), 7.37 (d, 3.6 Hz, 1H), 6.58 (d, 3.6 Hz, 1H), 4.63 (s, 2H)。13C NMR (150 MHz, CD3COCD3)δ178.1, 162.9, 153.4, 123.8, 110.2, 57.5。

化合物4：無色針狀晶體。ESIMS(m/z): 179 [M-H]-。1H NMR (600 MHz, CD3COCD3)δ12.93 (s, 1H), 9.50 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.01(s, 3H)。13C NMR (150 MHz, CD3COCD3)δ203.1, 160.6, 160.6, 130.3, 115.9, 112.2, 110.3， 26.2, 16.2, 8.2。

化合物5：淡黃色針狀晶體。 ESIMS(m/z): 309 [M+H]+。1H NMR (600MHz, CD3SOCD3)δ11.60 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.42 (dd, 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.82 (dd, 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.65 (t, 7.8, 8.0 Hz, 1H), 7.42 (d, 3.6 Hz, 1H), 7.35 (t, 7.8, 8.0 Hz, 1H), 6.62 (d, 3.6 Hz, 1H), 4.69 (s, 2H)。13C NMR (150 MHz, CD3SOCD3)δ166.9, 157.7, 151.7, 141.8, 137.4, 132.9, 132.3, 130.3, 129.4, 122.5, 121.4, 121.0, 116.2, 113.2, 111.5, 109.7, 56.4。

化合物6：黃色油狀物。ESIMS(m/z): 393 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ6.60 (d, 9.6 Hz, 1H), 6.02 (d, 9.6 Hz, 1H), 5.73 (s, 1H), 5.24 (dd, 7.5, 15.1 Hz, 1H), 5.18 (dd, 7.5, 15.1Hz, 1H,), 2.52 (m, 1H), 2.46 (m, 1H), 2.33 (m, 2H), 2.11 (m, 1H), 2.08 (m, 2H), 1.98 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 1.78 (m, 1H), 1.77 (m, 1H), 1.66 (m, 1H), 1.60 (m, 1H), 1.45 (m, 1H), 1.43 (m, 1H), 1.25(m, 1H)，1.23 (m, 1H), 1.05 (d, 6.7 Hz, 3H), 0.99 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 0.93 (d, 6.8 Hz, 3H), 0.84 (d, 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, 6.8 Hz, 3H)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)δ199.5, 164.3, 156.1, 135.0, 134.0, 132.5, 124.5, 124.4, 123.0, 55.7, 44.3, 44.0, 42.9, 39.3, 36.7, 35.6, 34.1, 34.1, 33.1, 27.7, 25.4, 21.2, 20.0, 19.6, 19.0, 18.9, 17.6, 16.6。

化合物7：無色針狀晶體。ESIMS(m/z): 415 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ5.35 (s, 1H), 3.57 (m, 1H), 1.25 (s, 3H), 0.92 (d, 6.9 Hz, 3H), 0.84 (t, 6.9 Hz, 3H), 0.82 (d, 7.0 Hz, 3H), 0.67 (s, 3H)。13C NMR ( 150 MHz, CDCl3)δ: 142.5, 121.7, 71.4, 57.6, 56.7, 51.0, 45.9, 43.2, 43.3, 39.9, 38.0, 37.0, 36.6, 34.6, 32.8, 32.6, 32.6, 29.8, 28.8, 26.6, 25.1, 23.6, 21.3, 20.0, 19.9, 19.6, 19.5, 12.2, 12.0。

化合物8：無色針狀晶體。ESIMS(m/z): 387 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ5.29 (d, 1H), 3.56 (q, 1H), 0.99 (s, 3H), 0.69 (s, 3H);13C NMR (150 MHz, CDCl3)δ140.7, 121.7, 71.8, 56.7, 56.4, 50.2, 42.5, 39.6, 39.7, 37.5, 36.5, 36.4, 35.7, 31.6, 31.6, 28.3, 28.2, 24.5, 23.6, 22.5, 22.5, 21.4, 19.1, 18.7, 11.5。

丁二酸和順丁烯二酸數(shù)據(jù)略。

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：1H NMRδ7.37 (d, 3.6 Hz, 1H), 6.58 (d, 3.6Hz, 1H)的芳香H從偶合常數(shù)和化學(xué)位移判斷是呋喃3，4位上的H，δ9.59 (s, 1H)是醛基的H，4.63 (s, 2H)結(jié)合13C NMRδ57.5表明分子中存在1個(gè)羥甲基，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，鑒定化合物1為5-羥甲基糠醛。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物2：1H NMRδ7.52 (dd, 8.4, 7.2 Hz, 1H), 7.02 (dd, 8.4, 1.2 Hz, 1H), 6.92 (dd, 1.2, 7.2 Hz, 1H)，提示存在1, 2, 3-三取代苯環(huán)，δ10.97 (s, 1H)的高尖峰是與羰基形成分子內(nèi)氫鍵的—OH信號(hào)，δ1.58 (d, 6.0 Hz, 3H)是和CH相連的甲基，δ4.68 (m, 1H), 4.58 (d, 2.4 Hz, 1H)是2個(gè)分別連氧的CH。以上數(shù)據(jù)結(jié)合13C NMR可判斷分子為有取代2個(gè)羥基、1個(gè)甲基的二氫異香豆素類化合物，有關(guān)波譜數(shù)據(jù)及比旋光度與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，確定化合物2為(3R,4R)-順-4-羥基蜂蜜曲菌素。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物3：1H NMR從峰形和數(shù)據(jù)上看與化合物2類似，提示仍屬于二氫異香豆素類，較明顯的區(qū)別在于化合物3的1H NMR只顯示δ7.18 (d, 9.0 Hz, 1H), 6.83 (d, 9.0 Hz, 1H)這2個(gè)互為鄰位的芳香H，表明與化合物2相比，苯環(huán)上1個(gè)H被取代。由于碳譜未顯示多余碳的信號(hào)，推測(cè)該取代基可能是羥基，波譜數(shù)據(jù)及比旋光度與文獻(xiàn)[19]基本一致，鑒定化合物3為(3R,4R)-順-4,7-二羥基蜂蜜曲菌素。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物4：1H NMRδ7.48 (s, 1H)結(jié)合13C NMR 表明分子中存在1個(gè)五取代苯環(huán)，1H NMRδ12.93 (s, 1H), 9.50 (s, 1H)是2個(gè)羥基，其中δ12.93 (s, 1H)的高尖峰與羰基形成了分子內(nèi)氫鍵，δ2.54 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.01(s, 3H)分別為3個(gè)甲基。由于分子中存在1個(gè)羰基，推測(cè)有其中1個(gè)甲基連在羰基上形成了1個(gè)乙?；?，另外2個(gè)甲基則直接連在苯環(huán)上。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]基本一致，鑒定化合物4為Clavatol。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物5：1H NMRδ11.60 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.42 (dd, 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.82 (dd, 8.0, 1.2 Hz, 1H), 7.65 (t, 7.8, 8.0 Hz, 1H), 7.35 (t, 7.8, 8.0 Hz, 1H)是典型的β-咔啉生物堿特征信號(hào)，δ7.42 (d, 3.6 Hz, 1H), 7.35 (t, 7.8, 8.0 Hz, 1H), 6.62 (d, 3.6 Hz, 1H), 4.69 (s, 2H)與化合物1進(jìn)行對(duì)比，判斷分子中存在1個(gè)2位被取代的5-羥甲基呋喃結(jié)構(gòu)單元，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]基本一致，鑒定化合物5為酒渣堿。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物6：氫譜和碳譜提示屬于甾醇類，1H NMRδ1.05 (d, 6.7 Hz, 3H), 0.93 (d, 6.8 Hz, 3H), 0.84 (d, 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, 6.8 Hz, 3H)是連在CH上的甲基，0.99 (s, 3H), 0.96 (s, 3H)是連在季碳上的甲基，1H NMRδ6.60 (d, 9.6 Hz, 1H), 6.02 (d, 9.6 Hz, 1H), 5.73 (s, 1H), 5.24 (s, 2H)及13C NMRδ1 164.3, 156.1, 135.0, 134.0, 132.5, 124.5, 124.4, 123.0說明分子中存在4個(gè)雙鍵，13C NMRδ199.5的信號(hào)表明分子中存在1個(gè)α，β不飽和羰基。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]基本一致，鑒定化合物6為麥角甾-4, 6, 8(14), 22-四烯-3酮。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物7和8結(jié)構(gòu)通過與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行核磁共振波譜、薄層層析及文獻(xiàn)[23-24]對(duì)照，確定為β-谷甾醇、3β-膽甾-5-烯-3-醇。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

丁二酸和順丁烯二酸通過與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行核磁共振波譜、薄層層析對(duì)照確定。

圖1 化合物1～8的分子結(jié)構(gòu)

2.4 抗植物病原菌活性測(cè)試結(jié)果

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)試了化合物1，2，4，5，6對(duì)番茄枯萎菌、香蕉炭疽菌和小麥赤霉菌的抗菌活性。一般認(rèn)為，抑菌圈在6～10 mm之間表示對(duì)該菌株有輕度抗菌作用，11～15 mm為中度抗菌，16～20 mm為高度抗菌[25]。由表1可知，在質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1時(shí)，化合物5對(duì)香蕉炭疽菌顯示了高度抗菌活性；化合物5和6對(duì)番茄枯萎菌和小麥赤霉菌顯示中度抗菌作用；化合物6對(duì)香蕉炭疽菌顯示輕度抗菌作用；其他測(cè)試化合物除化合物1對(duì)番茄枯萎菌無抗菌活性外，均對(duì)3種測(cè)試菌株顯示了輕度抗菌活性。

表1 化合物1、2、4、5和6的抗植物病原菌活性1)

Tab.1 Antifungal activities of compounds 1, 2, 4, 5 and 6 against plant pathogens

化合物抑菌圈直徑/mm番茄枯萎菌香蕉炭疽菌小麥赤霉菌化合物16．37±0．53Bb9．37±0．83Dd6．15±0．41Bb化合物210．33±0．71Dd6．45±0．46Bb7．06±0．34Bc化合物48．93±0．38Cc7．80±0．50Cc8．43±0．56Cd化合物512．23±0．47Ee19．47±0．64Ee11．23±0．37Df化合物612．50±0．75Ee7．73±0．54Cc10．26±0．63De多菌靈15．83±0．65Ff26．53±0．20Ff18．57±0．18Eg空白對(duì)照0．00±0．00Aa0．00±0．00Aa0．00±0．00Aa

1) 表中數(shù)據(jù)為6組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后凡是具有一個(gè)相同大、小寫字母者，表示0.01、0.05水平差異不顯著(Duncan’s法)。

3 討論與結(jié)論

從該紅樹內(nèi)生真菌共分離鑒定了10種化合物，結(jié)構(gòu)類型具有多樣性，有呋喃衍生物、異香豆素、生物堿、甾醇等。其中化合物2、3、4、5鮮見從Fusarium屬真菌中分離得到。濾紙片擴(kuò)散法抗菌活性測(cè)試表明，在質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1時(shí)，化合物5對(duì)香蕉炭疽菌顯示了高度抗菌活性，對(duì)番茄枯萎菌和小麥赤霉菌顯示了中度抗菌作用；化合物6對(duì)番茄枯萎菌和小麥赤霉菌顯示中度抗菌作用，推測(cè)它們是提取物顯示抗植物病原菌的重要原因之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物1有抗氧化及抑制皮膚黑色素瘤細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性[26]，化合物2對(duì)P388小鼠白血病細(xì)胞和枯草芽孢桿菌有很高的抑制活性[27]，化合物4對(duì)金黃色葡萄球菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和多藥耐藥金黃色葡萄球菌有中度抗菌活性[19]，化合物5有很強(qiáng)的抑制HL-60細(xì)胞增殖活性[28]，化合物6對(duì)HL-60細(xì)胞顯示強(qiáng)細(xì)胞毒活性[29]，但鮮見上述化合物對(duì)這3種植物病原菌的抗菌活性報(bào)道，本文的研究豐富了天然微生物源農(nóng)藥抗菌化合物庫(kù)。

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【責(zé)任編輯 李曉卉】

Study on the metabolites of a mangrove endophytic fungusFusariumsp.

LI Wensheng, ZHOU Danli, LU Yingchi, ZHONG Haoran, ZHU Xinwei, DING Weijia, LI Chunyuan

(College of Materials and Energy, South China Agricultural University, Guangzhou 510642，China)

【Objective】 To study the metabolites of a mangrove fungusFusariumsp. R5. 【Method】The fermented filtrate of R5 fungus was isolated by silica gel column chromatography. The structures of the metabolites were characterized by spectral analyses. The antifungal activities were investigated using the paper disc-agar diffusion method. 【Result】Ten compounds were isolated and identified as 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde (compound 1), (3R,4R)-cis-4-hydroxymellein (compound 2), (3R,4R)-cis-4,7-dihydroxymellein (compound 3), clavatol (compound 4), flazine (compound 5), ergosta-4, 6, 8(14), 22-tetraen-3-one (compound 6),β-sitosterol (compound 7), 3β-cholest-5-en-3-ol (compound 8), butanedioic acid and maleic acid. At the concentration of 250 μg·mL-1, compound 5 showed high inhibitory activity againstColletotrichummusae(Berk.&M. A. Curtis) Arx.， compounds 5 and 6 showed moderate inhibitory activity againstF.oxysporumandF.graminearumSchw.【Conclusion】Compounds 1～8 are isolated fromFusariumsp. and among them, compounds 5 and 6 could be used as the lead compounds in antifungal agents.

mangrove endophytic fungus;Fusariumsp.; metabolite; antifungal activity

2016- 07- 01 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-04-12

李文生(1990—)，男，碩士研究生，E-mail: 719831629@qq.com； 通信作者： 丁唯嘉(1979—)，女，講師，博士，E-mail: dwjzsu@scau.edu.cn；李春遠(yuǎn) (1978—)，男，教授，博士，E-mail: chunyuanli@scau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(21102049)；廣東省自然科學(xué)基金 (2015A030313405，9451064201003751)；廣東省科技計(jì)劃(2016A020222019)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金([2015]311)；2017廣州市科技計(jì)劃科學(xué)研究一般項(xiàng)目(201707010342)；廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃(201610564225，201510564196)

O629

A

1001- 411X(2017)03- 0064- 06

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李文生， 周丹麗， 陸盈池， 等.1株紅樹內(nèi)生真菌Fusariumsp.代謝產(chǎn)物的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(3):64- 69.